■高安崇 肖永仁 孫永峰 楊連玉*

（1.吉林大學(xué)農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)基地，吉林長(zhǎng)春130062；2.吉林省樺甸市畜牧業(yè)管理局，吉林樺甸132400；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

理想氨基酸模型是一種氨基酸平衡的模型。所謂平衡是指模型中的氨基酸比例接近機(jī)體合成每一種特定蛋白質(zhì)所需的氨基酸比例。因此，建立理想氨基酸模型有利于在配制動(dòng)物日糧時(shí)，使其各種所需氨基酸的比例盡可能的接近動(dòng)物機(jī)體之所需[1]。在玉米-豆粕型飼糧中，蛋氨酸和賴氨酸通常是鵝的第一和第二限制性氨基酸。所以依據(jù)蛋氨酸和賴氨酸的配比設(shè)計(jì)日糧氨基酸模型，可以在一定程度上接近鵝理想氨基酸模型，以滿足鵝對(duì)氨基酸的需要。目前，設(shè)計(jì)理想氨基酸模型的方法有很多，但在國(guó)內(nèi)僅史旭升等[2]通過(guò)對(duì)蛋氨酸和賴氨酸需要量的研究，設(shè)計(jì)出0～4周齡農(nóng)安籽鵝飼糧氨基酸模型。本試驗(yàn)采用玉米-豆粕型飼糧，利用在飼料中添加不同水平蛋氨酸和賴氨酸，根據(jù)5～8周齡農(nóng)安籽鵝生產(chǎn)性能及血液激素和肝臟IGF-Ⅰ表達(dá)量在不同組別之間的差異，設(shè)計(jì)出農(nóng)安籽鵝日糧氨基酸模型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用鵝選用同一批次、體重相近健康的5周齡農(nóng)安籽鵝80只，隨機(jī)分為4組，每組20只。從5周齡開(kāi)始試驗(yàn)飼養(yǎng)至第8周，共28 d，每個(gè)重復(fù)分別取體型相近的6只鵝，進(jìn)行試驗(yàn)。按照正規(guī)方法組織采樣，采集鵝肝臟組織，保存于-80℃超低溫冰箱。

1.2 日糧組成及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基礎(chǔ)日糧配方參照NRC(1994)家鵝飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配置試驗(yàn)日糧，日糧組成及主要營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。選取賴氨酸和蛋氨酸兩個(gè)因素，采用2×2二因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，飼料中蛋氨酸水平分別為0.35%、0.50%，賴氨酸水平分別為0.85%、0.75%，試驗(yàn)處理見(jiàn)表2。根據(jù)試驗(yàn)得出的最佳蛋氨酸和賴氨酸組合，參照中國(guó)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表設(shè)計(jì)氨基酸模型。

1.3 血液激素檢測(cè)

第8周齡每組取6只鵝斷頭采血，血清保存在-20℃。放射免疫法測(cè)定血清胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、生長(zhǎng)激素(GH)和胰島素(INS)，所用試劑購(gòu)自天津九鼎生物工程公司。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

表2 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)（%）

1.4 生產(chǎn)性能指標(biāo)測(cè)定

每日記錄飼料消耗，每周末記錄體重，計(jì)算料重比、平均日增重。

1.5 主要試劑和儀器

總RNA提取試劑TRIZOL、Taq酶、回收試劑盒、克隆載體試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，Realtime PCR Master Mix購(gòu)自TOYOBO公司；熒光定量PCR儀（STEPONE PLUS型）購(gòu)自ABI公司。

1.6 總RNA提取和cDNA合成

按Trizol試劑盒說(shuō)明提取各組織總RNA。測(cè)定總RNA的濃度和純度,用變性瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA完整性。組織中總RNA的cDNA合成按試劑盒說(shuō)明操作。

1.7 引物及探針設(shè)計(jì)

鵝IGF-Ⅰ和beta-actin的引物根據(jù)NCBI上登錄的鵝 IGF-Ⅰ序列（DQ662932）和 beta-actin序列(M26111)設(shè)計(jì)合成，序列分別見(jiàn)表3。探針和引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

表3 引物及探針

1.8 TaqMan熒光RT-PCR

TaqMan RT-PCR 25 μl體積體系如下：1 μl上游引物、1 μl下游引物、0.5 μl TaqMan探針、12.5 μl Realtime PCR Master Mix、2 μl cDNA、8 μl蒸餾水。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性15 s；60℃退火1 min。

1.9 重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒制備

1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RT-PCR結(jié)果，回收電泳得到的片段，回收片段與pMD 18-T Vector載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，克隆過(guò)程參照TaKaRa pMD18-T Vector試劑盒說(shuō)明書。經(jīng)質(zhì)粒提取，做pcr鑒定后，獲得陽(yáng)性克隆送交華大中天生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.10 重組質(zhì)粒定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖1 IGF-Ⅰ重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增

測(cè)定陽(yáng)性重組質(zhì)粒的OD值,計(jì)算出拷貝數(shù)。將標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒進(jìn)行7個(gè)梯度，10倍系列稀釋,以系列稀釋的質(zhì)粒為模板在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。本試驗(yàn)采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)差異。試驗(yàn)中每份樣品所含的拷貝數(shù)都可通過(guò)Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較而得到。試驗(yàn)結(jié)果采用相對(duì)熒光定量即目的基因copies/內(nèi)參copies（F值）來(lái)表示，本試驗(yàn)以beta-actin基因?yàn)閮?nèi)參。

1.11 數(shù)據(jù)分析

用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件的Anova過(guò)程對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan's法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽(yáng)性質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增鑒定

陽(yáng)性質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增鑒定以IGF-Ⅰ基因重組質(zhì)粒DNA作模板，用IGF-Ⅰ引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果分別可見(jiàn)為120 bp的條帶（見(jiàn)圖1）。以beta-actin基因重組質(zhì)粒DNA作模板，用beta-actin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果分別可見(jiàn)為80 bp的條帶（見(jiàn)圖2）。同時(shí)，兩個(gè)基因陽(yáng)性質(zhì)粒的測(cè)序鑒定結(jié)果顯示，插入片段序列與NCBI上公布的序列同源性為100%。

圖2 beta-actin重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了鵝IGF-ⅠcDNA和beta-actin cDNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，IGF-Ⅰ：y=-3.066x+20.004；betaactin：y=-3.213x+20.476，其中，y代表Ct值；x代表模板量的對(duì)數(shù)值。Ct值和起始模板copy數(shù)均具有較好的相關(guān)性（IGF-Ⅰ：R2=0.996、beta-actin：R2=0.995）。

2.3 生產(chǎn)性能指標(biāo)(見(jiàn)表4)

由表4可知，不同蛋氨酸水平的日糧對(duì)鵝的平均末重、日增重、料重比均有顯著影響（P＜0.05），當(dāng)日糧蛋氨酸水平提高時(shí)，料重比降低，增重速度加快，平均末重0.5%蛋氨酸水平顯著高于0.35%水平。不同賴氨酸水平的日糧對(duì)鵝平均末重和日增重的影響產(chǎn)生顯著差異（P＜0.05），其中較高水平賴氨酸（0.85%）組鵝的平均末重和增重速度都顯著高于較低水平賴氨酸（0.75%）組，對(duì)平均日采食量影響不顯著（P＞0.05）。不同水平的蛋氨酸和賴氨酸之間的交互作用對(duì)平均末重、日增重、料重比均有顯著影響（P＜0.05），對(duì)平均日采食量影響不顯著（P＞0.05），當(dāng)飼糧營(yíng)養(yǎng)水平為3組時(shí)，平均末重和日增重最高，料重比最低。

表4 不同處理對(duì)鵝生產(chǎn)性能的影響

2.4 血清中激素水平（見(jiàn)表5）

表5 各處理組血清激素濃度

由表5可知，飼糧中不同蛋氨酸水平對(duì)血清中IGF-Ⅰ的濃度影響顯著(P＜0.05)，0.5%蛋氨酸水平組血清中IGF-Ⅰ的濃度顯著高于0.35%蛋氨酸水平組。不同賴氨酸水平對(duì)血清中IGF-Ⅰ的濃度影響顯著(P＜0.05)，0.85%組血清中IGF-Ⅰ的濃度顯著高于0.75%組。不同的蛋氨酸和賴氨酸水平對(duì)血清中GH和INS的濃度影響均不顯著(P＞0.05)。不同水平的蛋氨酸和賴氨酸之間的交互作用對(duì)血清中IGF-Ⅰ的濃度影響顯著(P＜0.05)，第3組的血清中IGF-Ⅰ、GH濃度最高。

2.5 肝臟組織中IGF-ⅠmRNA表達(dá)量(見(jiàn)表6)

表6 不同處理對(duì)鵝肝臟IGF-I基因表達(dá)量的影響

從表6可以看出，飼糧中不同蛋氨酸水平對(duì)肝臟組織中IGF-ⅠmRNA表達(dá)量有著顯著的影響（P＜0.05），0.5%蛋氨酸水平組肝臟組織中IGF-ⅠmRNA表達(dá)量顯著高于0.35%蛋氨酸水平組。不同賴氨酸水平對(duì)肝臟組織中IGF-ⅠmRNA表達(dá)量影響不顯著（P＞0.05）。不同水平的蛋氨酸和賴氨酸之間的交互作用對(duì)鵝肝臟組織中IGF-ⅠmRNA表達(dá)量具有極顯著的影響（P＜0.01），3組和4組極顯著高于1組（P＜0.01），顯著高于2組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 不同蛋氨酸和賴氨酸水平及其交互作用對(duì)農(nóng)安籽鵝生產(chǎn)性能的影響

蛋氨酸和賴氨酸作為鵝玉米-豆粕型日糧的第一和第二限制性氨基酸，如果攝入量不足，會(huì)降低鵝對(duì)其它氨基酸的利用率，進(jìn)而對(duì)生產(chǎn)性能產(chǎn)生影響。前蘇聯(lián)建議4～8周齡鵝蛋氨酸需要量為0.45%，賴氨酸需要量為0.9%，澳大利亞建議4～8周齡鵝蛋氨酸的需要量為0.4%，賴氨酸需要量為0.95%，李文立等[3]在對(duì)育成期五龍鵝的研究中發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸和賴氨酸最適宜飼糧水平為0.33%和0.7%。王志躍等[4]在對(duì)5～10周齡揚(yáng)州鵝的理想氨基酸模型的研究中報(bào)道，5～10周齡揚(yáng)州鵝蛋氨酸和賴氨酸占日糧的百分比應(yīng)為0.36%和0.78%。本研究表明，當(dāng)日糧蛋氨酸水平為0.5%時(shí)，平均末重和日增重顯著提高，料重比顯著降低；當(dāng)日糧賴氨酸水平為0.85%時(shí)，平均末重和日增重顯著提高。有研究中提到，日糧中適量添加蛋氨酸可以提高28～70 d吉林白鵝的生產(chǎn)性能，但隨著蛋氨酸添加量的提高，生產(chǎn)性能會(huì)有先升后降的趨勢(shì)，適宜的添加量應(yīng)在0.43%～0.83%之間[5]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相符，說(shuō)明0.5%的蛋氨酸添加量較為適宜。在一定的范圍內(nèi)，適量提高飼糧賴氨酸水平，可有效提高公雞的體重、日增重，降低料重比等[6]，梁遠(yuǎn)東[7]研究發(fā)現(xiàn)，5～8周齡仔鵝最佳飼糧賴氨酸添加量為0.85%，這與本研究結(jié)果一致。在本研究結(jié)果中，蛋氨酸和賴氨酸的交互作用對(duì)農(nóng)安籽鵝平均末重、日增重和料重比有顯著影響，理想的組合為3組（0.5%Met和0.85%Lys），與李文立等[3]提出的提高鵝生產(chǎn)性能最適宜的蛋氨酸水平為0.33%～0.43%，賴氨酸水平為0.7%～0.8%的結(jié)果稍有差異，可能與鵝品種和日齡有關(guān)。

3.2 不同蛋氨酸和賴氨酸水平及其交互作用對(duì)農(nóng)安籽鵝血清中激素水平的影響

張永翠等[8]對(duì)肉兔的研究中發(fā)現(xiàn)，不同蛋氨酸飼料添加水平對(duì)血清中INS和GH的含量無(wú)顯著影響，對(duì)IGF-Ⅰ含量影響顯著，隨著蛋氨酸添加水平的增高，呈現(xiàn)先高后低的趨勢(shì)。有學(xué)者在對(duì)黑山羊的研究中發(fā)現(xiàn)，降低日糧賴氨酸添加水平，會(huì)使血清IGF-Ⅰ濃度比對(duì)照組低14%[9]。本試驗(yàn)結(jié)果與上訴研究結(jié)果基本相符，即提高日糧中蛋氨酸和賴氨酸水平，可使血清中IGF-Ⅰ的濃度增加，而GH和INS則不受影響。這也與史旭升等[2]的研究結(jié)果相一致。蛋氨酸和賴氨酸的交互作用對(duì)農(nóng)安籽鵝血清中IGF-Ⅰ濃度有顯著影響，其中試驗(yàn)組3組（0.5%Met和0.85%Lys）濃度最高。

3.3 不同蛋氨酸和賴氨酸水平及其交互作用對(duì)農(nóng)安籽鵝肝臟組織中IGF-ⅠmRNA表達(dá)量的影響

有研究表明，動(dòng)物肝臟中IGF-ⅠmRNA表達(dá)量受到日糧蛋白質(zhì)水平的影響[10-12]，Brameid等[13]認(rèn)為，蛋白質(zhì)對(duì)IGF-Ⅰ基因的表達(dá)主要以氨基酸的形式調(diào)控。在本試驗(yàn)中，提高蛋氨酸水平會(huì)使肝臟組織中IGF-ⅠmRNA表達(dá)量增加，但賴氨酸改變水平卻不會(huì)對(duì)IGF-ⅠmRNA表達(dá)量產(chǎn)生顯著變化，但隨著賴氨酸水平的提高IGF-ⅠmRNA表達(dá)量會(huì)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。在杜希海等[5]的研究中，0.5%水平的蛋氨酸添加量組使70日齡吉林白鵝背部、胸部和腹部的IGF-ⅠmRNA表達(dá)量最高。與本試驗(yàn)結(jié)果基本相同。井文倩等[14]報(bào)道，隨著賴氨酸飼料中添加量的提高，70～90日齡的肉兔肝臟中IGF-ⅠmRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。從本試驗(yàn)中可以看出，若要5～8周齡農(nóng)安籽鵝肝臟中IGF-ⅠmRNA表達(dá)量達(dá)到峰值，日糧中賴氨酸水平應(yīng)不高于0.85%。

4 結(jié)論

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，5～8周齡農(nóng)安籽鵝最適宜生長(zhǎng)發(fā)育的飼料蛋氨酸水平為0.50%，賴氨酸水平為0.85%，最適宜的蛋氨酸和賴氨酸組合為0.50%蛋氨酸＋0.85%賴氨酸。參照中國(guó)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表設(shè)定日糧氨基酸模型為：賴氨酸100，蛋氨酸59，胱氨酸34，蘇氨酸83，異亮氨酸83，亮氨酸 199，精氨酸129，纈氨酸98，組氨酸55，酪氨酸79，苯胺酸110，色氨酸13。