■徐巧云 王夢(mèng)芝* 霍永久 羅昱宏

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2.濱海普潤(rùn)生物科技有限公司，江蘇鹽城224500）

隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)和人們生活水平的不斷提高，人們對(duì)牛奶的需求數(shù)量以及牛奶的品質(zhì)要求也不斷提升。影響牛奶質(zhì)量的因素很多，而預(yù)防奶牛疾病，提高免疫力，降低病原微生物的侵襲是培育健康奶牛的重點(diǎn)工作[1]。近年來(lái)，微生態(tài)制劑已成為公認(rèn)的理想抗生素替代品，其能有效地增加有益菌的數(shù)量，抑制病原微生物菌群的定植，從而改善腸道微生態(tài)平衡，提高機(jī)體免疫力[2]。尤升波等[3]添加乳酸菌、酵母菌等復(fù)合微生態(tài)制劑，在一定程度上增強(qiáng)奶牛抗熱應(yīng)激能力，改善其泌乳性能，減緩奶牛夏季高溫條件下奶產(chǎn)量下滑的情況。屎腸球菌作為腸道常見(jiàn)的益生菌不僅可以通過(guò)生物拮抗、生物奪氧、增加有益菌數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能，并且具有提高飼料轉(zhuǎn)化率,改善生產(chǎn)性能,提高動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)等作用[4]。研究表明，6周齡雌性小鼠口服屎腸球菌可以顯著增加小鼠血漿中IgG濃度，白細(xì)胞介素4（IL-4），白細(xì)胞介素-6（IL-6）和干擾素-γ（IFN-γ）水平[5]。Pollmann等[6]研究屎腸球菌對(duì)豬自然衣原體感染率時(shí)發(fā)現(xiàn)，給飼喂添加有屎腸球菌的日糧后，斷奶仔豬腸道內(nèi)定植的致病菌有所下降,并且仔豬腹瀉情況也有所緩解。朱芬花等[7]研究表明，在平均日采食量、平均日產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、IgG含量、IgA含量、IgM含量中，III組（精飼料與粗飼料比60∶40）顯著高于I組（精飼料與粗飼料比40∶60）。

屎腸球菌在培養(yǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生大量的乳酸,屬乳酸菌[8]。在復(fù)合乳酸菌對(duì)奶牛泌乳性能、血液免疫和抗氧化指標(biāo)的影響的研究中，劉華偉等[9]發(fā)現(xiàn)飼喂30 g/d乳酸菌制劑與對(duì)照組相比，顯著提高了奶牛的產(chǎn)奶量，并且奶牛血清中免疫球蛋白G(IgG)和可溶性CD4(SCD4)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH)的活性均顯著升高。綜上所述，提高產(chǎn)奶量，改善乳品質(zhì)與動(dòng)物本身的健康存在一定的聯(lián)系。為此，本試驗(yàn)以屎腸球菌為研究對(duì)象，在奶牛飼糧中添加不同量的屎腸球菌的方式來(lái)觀察其血清生化、抗氧化、免疫指標(biāo)的變化，以期為探討益生菌與促進(jìn)牛奶品質(zhì)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（基礎(chǔ)日糧）、低劑量組[基礎(chǔ)日糧+30 g/(d·頭)屎腸球菌]、高劑量組[基礎(chǔ)日糧+60 g/(d·頭)屎腸球菌]，每組8個(gè)重復(fù)。選擇24頭體重、胎次（1～2胎）、泌乳期（40±2）d、泌乳量（21.0±1.0）kg、體況（3.0分）等性狀相對(duì)一致的荷斯坦奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)期為42 d，包括預(yù)試期14 d，正試期28 d。根據(jù)揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)提供并參照NRC（2001）[10]奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧，日糧采用TMR混合機(jī)混合（基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1）。保證試驗(yàn)?zāi)膛＞潭ú畚?，適當(dāng)運(yùn)動(dòng)，自由飲水，飼養(yǎng)管理皆保持一致。本試驗(yàn)屎腸球菌由濱海普潤(rùn)生物科技有限公司提供，為粉狀，白色，使用石灰粉攪拌稀釋，細(xì)菌數(shù)含量為1.0×1010CFU/g。同舍分單圈飼養(yǎng)試驗(yàn)牛，每天早晚適量飼喂2次（添加劑先與部分日糧先混合，再混合），分早、中、晚3次擠奶。

1.2 樣品采集

分別在正試期第0、14、28 d晨飼前采集尾靜脈血樣，部分加入EDTA·Na2抗凝管中，用于血常規(guī)分析，部分加入促凝管中，3 000 r/min離心5 min獲取血清，用于免疫球蛋白等生化指標(biāo)測(cè)定。

1.3 血清免疫球蛋白IgA、IgG及IgE測(cè)定

購(gòu)買北京華英生物技術(shù)研究所的牛IgA、IgG、IgE檢測(cè)試劑盒，進(jìn)行測(cè)定血清中IgA、IgG及IgE，具體測(cè)定步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.4 血清免疫細(xì)胞因子IL-1、IL-6及TNF-α測(cè)定

均采用放射免疫法測(cè)定，所使用的IL-1、IL-6、ALCAM及TNF-α檢測(cè)ELISA試劑盒均購(gòu)自上海R&B公司，具體測(cè)定步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 血常規(guī)及血液生化指標(biāo)測(cè)定

血清樣品送至揚(yáng)州市疾病控制中心測(cè)定總蛋白、白球比、膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇濃度及谷草轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)。

1.6 血清抗氧化等指標(biāo)測(cè)定

還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和丙二醛的測(cè)定分別采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所獲得的數(shù)據(jù)資料采用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯氏多重比較。P值小于0.05為顯著差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 屎腸球菌對(duì)荷斯坦奶牛血常規(guī)和血液生化指標(biāo)的影響（見(jiàn)表2、表3）

由表2可知，添加屎腸球菌在白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞平均體積、平均血紅蛋白含量、平均血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞分布寬度、紅細(xì)胞分布標(biāo)準(zhǔn)差上無(wú)明顯差異（P＞0.05）；紅細(xì)胞低劑量組顯著高于高劑量組（P＜0.05），與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）；時(shí)間上，除紅細(xì)胞分布寬度在第28 d顯著低于第0、14 d（P＜0.05），其他指標(biāo)均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

由表3可知，白蛋白、堿性磷酸酶、總膽固醇、總蛋白、血中尿素氮、甘油三酯在處理組和時(shí)間軸上無(wú)顯著差異（P＞0.05）；高劑量組乳酸脫氫酶顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），與低劑量組相比差異不明顯（P＞0.05），時(shí)間軸上，白蛋白含量差異不顯著（P＞0.05）；低劑量組在谷丙轉(zhuǎn)氨酶和血糖中與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05），但顯著高于高劑量組（P＜0.05），谷丙轉(zhuǎn)氨酶在時(shí)間軸上無(wú)顯著差異（P＞0.05），但血糖在時(shí)間上差異顯著（P＜0.05），并隨著時(shí)間變化逐步增高；谷草轉(zhuǎn)氨酶在低劑量組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），與高劑量組相比差異不顯著（P＞0.05）；高密度脂蛋白含量在第28 d顯著低于第0、14 d，但處理組間差異不明顯（P＞0.05）；對(duì)照組低密度脂蛋白與高劑量組無(wú)顯著差異（P＞0.05），但高于低劑量組（P＜0.05），時(shí)間上，第28 d與第14 d差異不顯著（P＞0.05），顯著高于第0 d（P＜0.05）。

2.2 對(duì)奶牛血清抗氧化和免疫指標(biāo)的影響(見(jiàn)表4)

由表4可知，丙二醛、還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），丙二醛濃度和還原型谷胱甘肽濃度在第28 d均顯著高于第14 d（P＜0.05），第14 d的超氧化物歧化酶活力與其他兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異不顯著（P＞0.05），但第0 d顯著低于第28 d（P＜0.05），過(guò)氧化氫酶的活力在第0 d顯著高于第14、28 d（P＜0.05）；IgG、IgA組間差異不明顯（P＞0.05），IgA時(shí)間上第14 d含量最高，第0 d其次，第28 d最低，第28 d的IgG含量顯著低于第0、14 d（P＜0.05）；高劑量組腫瘤壞死因子顯著低于對(duì)照組和低劑量組，腫瘤壞死因子在第28 d的含量顯著低于第0、14 d（P＜0.05）；白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素6在處理和時(shí)間上無(wú)顯著差異（P＞0.05）；細(xì)胞黏附因子處理組間無(wú)明顯差異（P＞0.05），但第28 d的含量顯著低于第0、14 d（P＜0.05）。

表2 屎腸球菌對(duì)血常規(guī)的影響

3 討論

3.1 屎腸球菌對(duì)荷斯坦奶牛血常規(guī)和血液生化指標(biāo)的影響

屎腸球菌是新培育出的乳酸菌類微生態(tài)制劑，屬于益生菌的一種，其能通過(guò)分泌有機(jī)酸和細(xì)菌素等物質(zhì)抑制有害菌的生長(zhǎng)，與致病菌競(jìng)爭(zhēng)，調(diào)整腸道菌群平衡，提高動(dòng)物健康水平[11]。血液作為動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境重要的組成部分之一，動(dòng)物機(jī)體的健康和代謝狀況可根據(jù)其生理生化指標(biāo)的改變進(jìn)行評(píng)估[12]。正常生理狀況下，血液中紅細(xì)胞的數(shù)量是處于穩(wěn)定狀態(tài)，其數(shù)量也可以根據(jù)紅細(xì)胞壓積來(lái)反應(yīng)。紅細(xì)胞具有吞噬、免疫、防御感染等作用，并且紅細(xì)胞的數(shù)量決定了血紅蛋白的數(shù)量，而血紅蛋白使紅細(xì)胞具有運(yùn)輸氧的功能[13]。研究證明，血液中紅細(xì)胞表面所具有的紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)(C3bRR)能使組織免遭循環(huán)免疫復(fù)合物沉積所致的損傷，黏附、清除免疫復(fù)合物,并且紅細(xì)胞也參與機(jī)體免疫功能[14]。饒家榮[15]通過(guò)對(duì)昆明荷斯坦奶牛紅細(xì)胞(RBC)C3bRR和免疫復(fù)合物花環(huán)(ICR)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)健康奶牛紅細(xì)胞膜上也具有C3b受體。另外，紅細(xì)胞膜上的多種免疫物質(zhì)及其細(xì)胞因子能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和分化，并參與T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等的免疫功能調(diào)節(jié)[16]。文靜等[17]在屎腸球菌對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能、免疫和抗氧化功能的影響的研究中發(fā)現(xiàn)飼喂添加屎腸球菌(菌含量為1×106CFU/g飼料)，提高了仔豬血清中C3、C4補(bǔ)體水平，分別為25.00%和76.08%。

表3 屎腸球菌對(duì)血清生化指標(biāo)的影響

王永等[11]研究表明，飼糧中添加300 mg/kg的屎腸球菌相對(duì)于抗生素組顯著提高了血液中的紅細(xì)胞總數(shù)和血紅蛋白含量。本試驗(yàn)中，低劑量組的紅細(xì)胞數(shù)量顯著高于高劑量組，且血紅蛋白和紅細(xì)胞壓積中低劑量組數(shù)值上高于其他兩組，說(shuō)明屎腸球菌可能通過(guò)促進(jìn)血紅蛋白含量從而促進(jìn)奶牛的免疫力。

表4 屎腸球菌對(duì)血液抗氧化和免疫指標(biāo)的影響

血糖的相對(duì)恒定對(duì)維持機(jī)體的正常生理功能有重要意義，其主要來(lái)源于小腸內(nèi)糖類的消化吸收和肝糖原的分解[18]。血糖濃度值過(guò)高或過(guò)低均不利于動(dòng)物的正常生理代謝[19]。血糖濃度的升高刺激機(jī)體釋放胰島素，從而促進(jìn)糖原、蛋白質(zhì)合成及脂肪的沉積，有利于機(jī)體的合成代謝；低血糖濃度的降低促進(jìn)胰高血糖的產(chǎn)生從而促進(jìn)糖異生和糖原分解[20]。林謙等[21]在益生菌與酶制劑對(duì)黃羽肉雞血液生化指標(biāo)和免疫性能影響的協(xié)同效應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)各組血清葡萄糖含量差異不顯著，但是益生菌與酶制劑組合添加組的血糖濃度相對(duì)較高，這說(shuō)明了益生菌與酶制劑兩者組合促進(jìn)腸道吸收入血液的葡萄糖量，有提高機(jī)體能量代謝水平的趨勢(shì)。有研究表明，飼糧中添加屎腸球菌混合添加劑或者單獨(dú)添加屎腸球菌，都能提高圍產(chǎn)奶牛泌乳量和血液中葡萄糖和胰島素的水平，降低游離脂肪酸水平[22]。本試驗(yàn)低劑量組血糖濃度與參考值(3.2±0.38)mmol/l接近，對(duì)照組和高劑量組相對(duì)較低，這說(shuō)明屎腸球菌低劑量組有促進(jìn)血糖穩(wěn)定的作用[23]。

機(jī)體內(nèi)大部分轉(zhuǎn)運(yùn)的脂肪酸被肝臟吸收后可通過(guò)酯化與磷脂、載體脂蛋白等結(jié)合形成脂蛋白，這里主要是極低密度脂蛋白。極低密度脂蛋白在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，失去甘油三酯，從而形成低密度脂蛋白，而低密度脂蛋白會(huì)進(jìn)一步形成高密度脂蛋白[24]。飼糧中添加益生菌有助于奶牛瘤胃菌群活力的激活，有益菌數(shù)量的增加及飼料中纖維分解速度的加快，從而促進(jìn)揮發(fā)性脂肪酸的合成,最終有利于提高泌乳量[25]。本試驗(yàn)中，低密度脂蛋白在低劑量組顯著低于其他兩組，而第0 d三組低密度脂蛋白含量差異本身較大，這可能是屎腸球菌促進(jìn)乳腺吸收血液中C16∶0等與極低密度蛋白結(jié)合的脂肪酸或者極高密度蛋白與多不飽和脂肪酸結(jié)合的形式[26]。乳酸脫氫酶主要存在于肝臟、心肌、腎臟等重要部位，是動(dòng)物體反應(yīng)能量代謝重要指標(biāo)之一，其主要功能是在糖代謝過(guò)程中催化丙酮酸產(chǎn)生乳酸[27]。有研究證明，當(dāng)動(dòng)物體有少量組織壞死時(shí)，組織中的乳酸脫氫酶會(huì)釋放進(jìn)入血液中，從而使其濃度增加[28]。另外，乳酸脫氫酶含量的高低也反映了奶牛的應(yīng)激狀態(tài)[18]。谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝臟中，谷草轉(zhuǎn)氨酶含量最多的組織是心臟和骨骼肌，其次是肝臟、肝臟細(xì)胞或某些損傷或壞死組織中[27]。谷丙轉(zhuǎn)氨酶正常值在14～38 U/l，谷草轉(zhuǎn)氨酶在78～132 U/l[29]。江科等[30]研究表明，每天飼喂乳酸菌，奶牛乳脂率、乳

蛋白率和乳糖含量與對(duì)照組相比差異不顯著，但泌乳量增加了1.59 kg/(頭·d)。本試驗(yàn)中，低劑量組乳酸脫氫酶含量在其他兩組之間，說(shuō)明低劑量組奶牛處于相對(duì)安靜、平穩(wěn)狀態(tài)。低劑量組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶濃度均在正常值范圍以內(nèi)，但低劑量組數(shù)值上均高于其他兩組，這可能是由于奶牛泌乳量的提高，對(duì)肝臟發(fā)生了一定程度的損害，從而使谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶濃度有所升高；谷草轉(zhuǎn)氨酶在對(duì)照組中濃度低于參考值，但隨著時(shí)間漸漸升高，可能是接近分娩造成的差異[20]。

3.2 屎腸球菌對(duì)奶牛血清抗氧化和免疫指標(biāo)的影響

氧化應(yīng)激指機(jī)體遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的高活性分子，例如活性氮自由基和活性氧自由基，過(guò)多氧自由基的積累會(huì)破壞抗氧化和氧化之間的平衡，導(dǎo)致機(jī)體生物大分子受損從而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[31]。研究證明，添加微生物制劑能有效地提高血清中超氧化物歧化酶的含量，而超氧化物歧化酶、還原性谷胱甘肽、丙二醛等抗氧化酶可以有效地預(yù)防氧自由基的堆積[32]。丙二醛是油脂氧化酸敗重要的有毒有害物質(zhì)之一，其可能通過(guò)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，促使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性受到損傷作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[33]。王永等[11]在飼糧中添加500 mg/kg的屎腸球菌研究表明，添加屎腸球菌可以降低血清中丙二醛水平，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。本試驗(yàn)中丙二醛含量隨時(shí)間顯著增加，這可能是本試驗(yàn)處于夏季，動(dòng)物應(yīng)激較大，但低劑量組丙二醛含量在數(shù)值上低于其他兩組。據(jù)文靜等[17]報(bào)道，屎腸球菌能提高仔豬免疫力，與對(duì)照組相比，仔豬血清中IgA、IgG和谷胱甘肽分別提高了16.48%、25.43%、46.80%，但總超氧化物歧化酶活力降低了10.38%。夏鍇等[8]在屎腸球菌飼用效果及作用機(jī)理中表明，添加屎腸球菌可以顯著提高仔豬胰臟中過(guò)氧化氫酶活性，降低丙二醛含量。肖麗霞等[34]給急性酒精性肝損傷小鼠飼喂屎腸球菌發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶和還原型谷胱甘肽含量顯著升高，但丙二醛含量顯著降低。

屎腸球菌在腸道內(nèi)迅速定植，消耗掉腸內(nèi)的氧氣和過(guò)氧化氫，降低了腸道內(nèi)氧化還原電位，形成良好的厭氧環(huán)境，且有研究證明，日糧中添加屎腸球菌可以顯著提高過(guò)氧化氫酶的活性[8]。M.Fukata等[35]研究表明，給小鼠飼喂選擇性乳酸桿菌可以抑制炎性細(xì)胞因子IL-1β、γ干擾素、腫瘤壞死因子-α信使RNA的表達(dá)。另外也有報(bào)道認(rèn)為嗜酸性乳酸桿菌等可刺激人類或小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞開(kāi)始成熟，細(xì)胞表面開(kāi)始呈現(xiàn)能夠捕獲抗原的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)，然后在MHC刺激下機(jī)體開(kāi)始合成腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-β(IL-β)和白細(xì)胞介素-12(IL-12)等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子[36]。Konstantinov等[37]報(bào)道，鼠李糖乳酸桿菌GG可減少腫瘤壞死因子對(duì)結(jié)腸上皮的損傷,促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。乳酸菌可以根據(jù)菌量的變化來(lái)調(diào)節(jié)IL-10、IL-1β、IFN-γ、TNF-α的含量[36]。本試驗(yàn)在丙二醛、還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶組中IgG、IgA、細(xì)胞黏附因子等無(wú)顯著影響，其中過(guò)氧化氫酶、IgG、IgA、腫瘤壞死因子、細(xì)胞激活黏附因子在時(shí)間軸上顯著降低，這可能是處于夏季，動(dòng)物應(yīng)激較大，免疫力下降，機(jī)體內(nèi)自由基過(guò)多，抗氧化反應(yīng)激烈。但高劑量屎腸球菌組在腫瘤壞死因子中顯著低于對(duì)照組和低劑量屎腸球菌組，這表明在日糧中添加屎腸球菌在一定程度上能夠提高機(jī)體抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疾病的抵抗能力。

4 結(jié)論

綜上表明，飼糧中低劑量的添加屎腸球菌，提高了紅細(xì)胞數(shù)量和抗腫瘤因子的濃度，降低了乳酸脫氫酶的濃度，有利于機(jī)體免疫力的提高。