■金海峰 孫曉蛟 魯 承

（1.延邊大學(xué)，吉林延吉133002；2.希杰飼料研究所，遼寧沈陽 110000）

硒（Se）與雄性繁殖機能關(guān)系密切，睪丸和附睪中 相對高濃度的硒通過合成硒蛋白參與精子發(fā)生過程中氧化還原反應(yīng)、睪酮合成、維持精子結(jié)構(gòu)等重要生理過程[1]。維生素E（VE）與機體繁殖機能也有很大關(guān)系。作用機理是促進垂體前葉分泌促性腺激素、調(diào)節(jié)性機能，促進和提高精子的形成與活動。睪丸出現(xiàn)變性萎縮，產(chǎn)生精子能力減弱或精子運動異常，是動物機體缺乏VE的典型癥狀。本試驗通過日糧中添加Se和VE，研究其對公羔羊精液品質(zhì)及抗氧化酶活性的影響，為闡明Se和VE的聯(lián)合添加對公羊生殖機能的作用機制及其后期在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2017年6月18日至8月20日，在吉林省某山羊養(yǎng)殖基地進行。

1.1 試驗動物

選擇出生30日齡、體重相近的公羔羊56只[體重(15.21±2.62)kg]作為試驗動物。

1.2 試驗日糧與設(shè)計

試驗開始前，試驗動物進行為期7 d的預(yù)飼期，飼喂無添加的基礎(chǔ)日糧。在7 d預(yù)飼期后，試驗山羊以3×2+1因子的處理方式被隨機分成7個處理組（每組8只）。其中硒（納米硒）三個水平(0.2、0.3、0.4 mg/kg)，維生素E 2個水平（100 IU/kg和200 IU/kg)，具體處理如下：①基礎(chǔ)日糧，G0；②基礎(chǔ)日糧+0.2 mg/kg Se和 100 IU/kg VE，G1；③基礎(chǔ)日糧+0.2 mg/kg Se和200 IU/kg VE，G2；④基礎(chǔ)日糧+0.3 mg/kg Se和100 IU/kg VE，G3；⑤基礎(chǔ)日糧+0.3 mg/kg Se和200 IU/kg VE，G4；⑥基礎(chǔ)日糧+0.4 mg/kg Se和100 IU/kg VE，G5；⑦基礎(chǔ)日糧+0.4 mg/kg Se和200 IU/kg VE，G6。納米硒由日本全藥動物保健品有限公司提供，硒含量為1%，飼料級維生素E購于浙江新和成股份有限公司，VE含量為50%。試驗日糧為全價顆粒料，亞硒酸鈉及維生素E均于加工過程中添加。試驗日糧的配制參照NRC（1985）山羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的營養(yǎng)水平設(shè)計，日糧由玉米秸稈、苜蓿草等粗飼料及玉米面、豆粕、葵花餅等精飼料組成。日糧組成及營養(yǎng)水平見表1，硒及維生素E添加量見表2。

1.3 樣品采集

在飼養(yǎng)試驗結(jié)束前1周，選擇生長發(fā)育正常，生理狀態(tài)良好的羊只，采集其精液，持續(xù)2 d，并測量羊只的精液量。在每次精液采集完以后，取100 μl用于精液品質(zhì)檢測，將剩余的精液于4 000 r/min離心機中離心10 min，離心后取精漿上清液，分裝于離心管中，保存于-20℃冰箱中，用于測定抗氧化物酶活性。

1.4 測定指標(biāo)和方法

精液品質(zhì)測定利用計算機輔助精子質(zhì)量檢測分析儀，采用Video Test Sperm 2.1精液品質(zhì)分析軟件測定精子密度、精子活力、精子的畸形率和頂體完整率。

精子抗氧化酶活性的測定，主要測定指標(biāo)有精漿中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA），其含量采用化學(xué)比色法測定，測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，具體操作方法按照試劑盒說明書使用。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

表2 試驗設(shè)計

1.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SAS 9.1進行二因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著性采用Duncan's法進行多重比較，數(shù)據(jù)以平均值表示，其中P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧補硒和VE對子代羔羊精液品質(zhì)的影響（見表3）

由表3可知，與對照組相比，補飼Se和VE對山羊射精量影響差異不顯著（P＞0.05），山羊的精子密度和精子活力顯著受到補飼硒和VE的影響（P＞0.05）。精子畸形率顯著受到硒和VE添加量的影響（P＜0.05）。同時，精子頂體完整率均顯著受硒和VE添加量的影響（P＜0.05），G1組的精子頂體完整率未顯著受到硒和VE添加量的影響（P＞0.05）。

2.2 日糧補硒和VE對羔羊精漿抗氧化酶活性的影響（見表4）。

表3 日糧補硒和VE對羔羊精液品質(zhì)的影響

表4 日糧補硒和VE對山羊精漿抗氧化酶活性的影響

由表4可知，與對照組相比，補飼Se和VE能顯著地增加精漿谷胱甘肽過氧化物酶活性和總抗氧化能力（P＜0.05）；G3組、G4組、G5組、G6組GSH-Px活性及總抗氧化能力顯著高于G0、G1及G2組（P＜0.05）。公羊精漿中SOD和CAT酶活性(G2組除外)顯著受到補飼硒和VE的影響（P＜0.05），MDA濃度顯著受到補飼硒和VE的影響（P＜0.05）。SOD、CAT和MDA試驗組間差異不受補飼硒和VE量的影響（P＞0.05）。

3 討論

3.1 日糧添加硒和維生素E對山羊精液品質(zhì)的影響

硒和VE均是機體必需的營養(yǎng)成分，對于動物生產(chǎn)和繁殖都有重要意義。在生產(chǎn)實踐中被用在提高生產(chǎn)性能、增強免疫力、改善繁殖性能、緩解應(yīng)激，主要是因為硒和VE可作為功能性添加劑來使用。王娟娟（2013）[2]研究了肉雞日糧中添加硒和VE的影響，結(jié)果表明脂多糖引起的應(yīng)激能通過在日糧中添加硒和VE來得到有效緩解，最佳添加劑量是0.2 mg/kg Se和200 mg/kg VE。蔣昊（2012）[3]研究表明，水牛的繁殖性能顯著受到日糧中添加1.6 mg/kg Se和200 mg/kg VE的影響。在羊的養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，育肥羊的生長性能和妊娠母羊的抗氧化性能顯著受到日糧硒和VE的影響[4-5]。本試驗在公羊日糧中添加不同水平的Se和VE，結(jié)果顯示公羊精液品質(zhì)、增加抗氧化酶活性得到了不同程度的提高，適合在實際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

硒和VE能夠?qū)π坌詣游锊G丸發(fā)育和精子形成有促進作用。谷朝勇（2005）[6]研究了魯西黃牛日糧中添加VE的作用表明，公牛精液品質(zhì)顯著受到日糧中VE濃度的影響。蘇惠龍等（2009）[7]研究了富硒益生菌對長白種公豬精液品質(zhì)的影響，結(jié)果顯示，試驗組種公豬精液中的精液品質(zhì)及酶活性高于對照組，精子畸形率低于對照組，說明種公豬的精液品質(zhì)明顯受到日糧中添加富硒益生菌的影響。王世超等（2010）[8]研究了酵母硒對種公牛精液品質(zhì)的影響，結(jié)果表明:種公牛的精子凍前活率和凍后活率顯著受到日糧中添加硒的影響，精子畸形率得到顯著降低(P＜0.05)，精液量、精子密度和精子頂體完整率則不受日糧加硒的影響。Yousef等（2003）[9]報道，雄兔精子濃度、射精量、總精子產(chǎn)量會通過飼喂VE得到顯著提高。閆治川等（2014）[10]報道，放牧的波爾山羊精子活力顯著受到注射硒元素的影響。

左兆云（2014）[11]闡明了VE對綿羊睪丸繁殖機能影響的分子機制，主要借助于基因芯片技術(shù)來完成。趙憲林等（2017）[12]結(jié)果表明，在兔子日糧中添加10～15 mg/d維生素E可以有效提高精子活力、成活率和精子頂體完整率，顯著提高A、B級精子百分率(P＜0.05)；顯著提高精子的前向性及精子曲線運動速度、直線運動速度(P＜0.05)。說明在兔子日糧中添加維生素E為10～15 mg/d時，可以有效提高新西蘭兔精液品質(zhì)。梅軍四等（2016）[13]研究了維生素E對不同品種的種公豬精液品質(zhì)的影響，結(jié)果表明飼料中添加38 mg/kg的維生素E改善了不同品種的種公豬的總精子數(shù)、精子密度、鮮精活率，能顯著降低種公豬精子畸形率。劉洪波等（2005）[14]研究了日糧中添加維生素E對綿山羊精液品質(zhì)影響，研究結(jié)果表明，綿、山羊采精量、精子密度和鮮精活率受到日糧中添加適宜劑量的維生素E的影響，改善了精液品質(zhì)(P＜0.05)。

本試驗結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，日糧添加Se和VE提高了山羊精子密度和頂體完整率，降低了精子畸形率。但是，公羊的射精量并沒有因硒和VE的添加得到提高。對照組和各補飼組公羊射精量在0.99～1.20 ml之間，均在山羊射精量正常范圍內(nèi)[15]。

3.2 日糧添加硒和維生素E對山羊精液抗氧化酶活性的影響

反映機體抗氧化能力的指標(biāo)主要有超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶活性及總抗氧化能力（T-AOC）。動物機體抗氧化物酶系統(tǒng)的兩個重要成員是谷胱甘肽過氧化物酶系和SOD，體內(nèi)的活性氧自由基水平以及脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物的含量直接受到其含量和活性的影響?？偪寡趸Γ═-AOC）含量一定程度上反應(yīng)機體遭受過氧化損傷的程度，是衡量機體總抗氧化能力的綜合指標(biāo)。

硒的抗氧化作用主要通過GSH-Px來發(fā)揮作用，是最早被發(fā)現(xiàn)和證實的含硒酶。能將還原型谷胱甘肽催化成氧化型，抑制過氧化反應(yīng)，清除自由基，對脂質(zhì)過氧化作用的損傷進行防御。

精漿中另一個關(guān)鍵的抗氧化酶是SOD，研究證實男性不孕不育可能是由于SOD活性過低所導(dǎo)致[16]。精液保存時間被延長，受精率被提高，往往伴隨著精漿SOD活性增高[17]。Se和VE的添加使得山羊精漿中SOD活性顯著提高，精子緩沖環(huán)境應(yīng)激造成損傷的能力得到增強。

MDA含量可反應(yīng)機體脂質(zhì)過氧化的程度，能使含氨基的蛋白質(zhì)、核酸等失活，間接反映細(xì)胞受損程度[18]。

衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)是T-AOC的含量，機體對外來刺激的代償能力及自由基代謝的狀態(tài)，也靠其來反映[19]。

有試驗數(shù)據(jù)也表明了維生素E對精子酶活性的影響。陳倩等(2012)[20]研究認(rèn)為日糧中補飼維生素E能提高遼寧絨山羊種公羊血漿維生素E含量(P＜0.05)、血漿 SOD 活性及 T-AOC(P＜0.05)，降低血漿MDA含量(P＜0.05)，射精量、精子活力及精子密度顯著受到VE添加量的影響(P＜0.05)。結(jié)果提示，補飼維生素E能顯著改善遼寧絨山羊種公羊血漿抗氧化指標(biāo)及精液品質(zhì)。

在本試驗中，精漿中CAT和T-AOC的活性顯著受到硒和VE添加的影響，活性顯著增強；MDA的濃度顯著受到VE添加的影響，濃度降低。Shamsi等（2009）[21]研究了男性不育患者精漿，其中的CAT和TAOC活性降低，精漿MDA含量較高，增加了精子畸形數(shù)量，與本試驗結(jié)果一致。日糧中添加硒和VE增強了精漿抗氧化酶系的活性，精子代謝過程中產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物MDA的數(shù)量降低，公羊的精液品質(zhì)得到了有效改善。

4 結(jié)論

日糧中添加硒和VE增強了精漿抗氧化酶系的活性，精子代謝過程中產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物MDA的數(shù)量降低，公羊的精液品質(zhì)得到了有效改善。日糧中適宜添加量硒為0.3 mg/kg，VE為100 IU/kg。