張開元，饒文霞，尹顯梅，陳 蓉，崔 欣，唐 卓*，尹鴻翔

1成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都 611137，2中國科學院成都生物研究所天然產物中心，成都 610041； 3成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，成都 611137

中藥重樓，來自百合科(Liliaceae)重樓屬(ParisL.)多年生草本植物。其中，七葉一枝花(ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara)與云南重樓(P.polyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)的干燥根莖被歷版《中國藥典》作為正品收載。重樓藥用歷史悠久，以“蚤休”之名始載于《神農本草經》，具有清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚之功效，可用于疔瘡癰腫，咽喉腫痛，蛇蟲咬傷，跌撲傷痛，驚風抽搐的治療[1]，是很多著名中成藥如云南白藥、宮血寧膠囊、抗病毒顆粒等的重要原料。

經過課題組前期對我國西南地區(qū)重樓人工種植基地的考察發(fā)現(xiàn)，由于重樓栽培正處于野生變家種的階段，種苗的生產和貿易缺乏行業(yè)規(guī)范，來源混亂，人工栽培品種除七葉一枝花(P.polyphyllavar.chinensis)與云南重樓(P.polyphyllavar.yunnanensis)之外，還包括多葉重樓(P.polyphyllavar.polyphylla)，狹葉重樓(P.polyphyllavar.stenophylla)，南重樓(P.vietnamensis)，五指蓮(P.axialisvar.axialis)，平伐重樓(P.vaniotii)，球藥隔重樓(P.fargesii)，黑籽重樓(P.thibeticavar.thibetica)，長柱重樓(P.forrestii)等多個近緣類群，品種十分混亂。而重樓以根莖入藥，根據(jù)性狀及顯微等特征難以對正品及其近緣混用種藥材進行有效區(qū)分，這給中醫(yī)處方和中成藥的質量控制方面帶來了極大的安全隱患[2]。因此，對正品重樓及其混用近緣種進行有效區(qū)分，在藥材生產和貿易中建立一種快速、準確的鑒別方法，對于重樓的用藥安全、質量控制以及重樓屬中瀕危種群的保護都有著十分重要的意義。

隨著分子生物學迅速發(fā)展，植物在DNA水平上的多樣性研究取得突破性進展，用于藥用植物的分子鑒定技術也日漸成熟[3]。對于重樓這一基原復雜的中藥，商品藥材的真?zhèn)舞b定工作既要實現(xiàn)藥典法定種和多個混用種的區(qū)分，又要兼顧2個藥典法定種的同時鑒別，另外還要避免云南重樓2個基因型導致的“假陰性”結果。然而，僅憑“1對引物”的普通PCR方法，將會需要3次PCR才能完成一份樣品的鑒別，顯然效率低、成本高。為了解決這一問題，本研究選擇rDNA-ITS作為鑒別序列，并將3對特異性引物集成到一個PCR體系中，僅需一次PCR即可實現(xiàn)上述鑒定效果，從而建立了對藥典法定重樓基原與其混用近緣種進行快速鑒別的多重PCR鑒別體系。

1 材料

1.1 藥材樣品

本次實驗材料包括七葉一枝花34份，云南重樓65份，多葉重樓17份，狹葉重樓10份，南重樓8份，五指蓮重樓5份，平伐重樓7份，球藥隔重樓22份，黑籽重樓13份，長柱重樓3份。實驗材料樣本采集地等詳細信息見表1。樣品經成都中醫(yī)藥大學尹鴻翔副教授鑒定，保存于成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院實驗室。

1.2 試劑

瓊脂糖(廣州賽國生物科技有限公司)，Goldview I型核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)，EasyTaq DNA polymerase，10× EasyTaq Buffer(Mg2+plus)(北京全式金生物技術有限公司)，DNAMarker -B，dNTPs Mixture Solution (生工生物工程股份有限公司)，植物組DNA提取試劑盒(成都福際生物技術有限公司)，α-高聚淀粉酶(思科生物科技有限公司)。

表1 實驗樣本信息Table 1 Sample information of Paris

續(xù)表1(Continued Tab.1)

樣品名稱Sample name采集地點Source部位Part份數(shù)Sample quantity樣品名稱Sample name采集地點Source部位Part份數(shù)Sample quantity貴州長順葉2貴州長順葉2?四川石棉葉1貴州安順葉2?四川彭州葉2貴州六枝葉7?球藥隔重樓(Q)P.fargesii四川崇州葉6四川石棉葉4四川平武葉1四川會理葉1四川大邑葉1四川大邑葉3?四川彭州葉7四川彭州葉3?江西黃洋界葉1四川彭州葉3湖南雙牌葉2四川鹽源葉、根莖2湖北來鳳葉、根莖3四川鹽邊葉、根莖2貴州水城葉1云南騰沖葉4黑籽重樓(HZ)P.thibetica var.thibetica四川大邑葉1云南金平葉1?四川平武葉1云南耿馬葉2?四川安縣葉2云南普洱葉2四川北川葉2云南普洱葉2?四川彭州葉2云南宣威葉8四川崇州葉2多葉重樓(DY)P.polyphylla var.polyphylla四川崇州葉1四川峨眉山葉2四川雅安葉1甘肅文縣葉1四川普格葉1長柱重樓(CZ)P.forrestii云南騰沖葉、根莖3

注：云南重樓樣品有“*”標識的為基因型II，未有標識的為基因型I。
Note:P.polyphyllavar.yunnanensissamples of genotype II were marked with "*",while samples of genotype I were unmarked.

1.3 儀器

Legend Micro 21R 離心機(美國 Thermo),BSA124S 分析天平(Sartorius科學儀器有限公司),MK-10干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司),PCR儀(杭州博日科技有限公司),DDY-12電泳系統(tǒng)(北京六一儀器廠),激光成像儀Typhoon 7000(通用電氣醫(yī)療集團生命科技部),微量紫外-分光光度儀(Thermo Nanodrop 2000)。

2 方法

2.1 基因組DNA提取

葉片樣品硅膠干燥，取30 mg，用植物組DNA提取試劑盒提取總DNA。根莖樣品研粉，過3號篩，取20 mg粉末，按照植物組DNA提取試劑盒說明書進行改進，加蛋白酶的同時添加20 μL的75% α-高聚淀粉酶提取總DNA，-4 ℃保存。DNA提取物用通用引物ITS-4/ITS-L[4]進行PCR擴增，擴增產物取7.5 μL，采用3%的瓊脂糖凝膠電泳成像和微量紫外-分光光度儀驗證DNA質量。通用引物序列見表2。

2.2 ITS測序及特異性引物設計與篩選

在多重PCR鑒別體系中，多對特異性引物的設計是最為關鍵的技術環(huán)節(jié)。用通用引物ITS-4/ITS-L對提取的重樓樣品DNA模板進行ITS序列擴增，每個樣品平行擴增3次，擴增產物送成都擎科梓熙生物科技有限公司進行測序。用Megalign軟件對測序結果進行序列校對與分析，找出具有穩(wěn)定差異的SNP位點，用Pirmer permier 5.0軟件在七葉一枝花和云南重樓的特有SNP位點區(qū)域分別設計特異性引物，并用設計的引物對重樓樣品DNA模板進行PCR擴增，篩選出特異性好，能夠準確區(qū)分兩個法定品種并能有效鑒別其他常見偽品的引物。

2.3 重樓多重PCR擴增體系的建立

PCR反應體系總體積25 μL，其中包括10×EasyTaq Buffer 2.5 μL，dNTPs mixture 280 μM，引物對H-F/H-R用量0.15/0.2 μM，引物對YN-IF2/YN-IR2用量0.25/0.15 μM，引物對YN-IIF3/YN-IIR21用量0.2/0.25 μM，EasyTaq DNA polymerase 1.5 U，模板DNA 30 ng，無菌雙蒸水補充體系至25 μL。PCR反應參數(shù)：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。PCR 擴增反應結束后，取PCR反應產物7.5 μL，加6×Loading buffer混勻后，于Goldview I染色的3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，220 V電壓下電泳20 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照保存。

3 結果

3.1 模板質量

采用通用引物ITS對本實驗所有的模板DNA進行擴增，均得到約700 bp左右的擴增條帶，表明本實驗的模板DNA質量符合PCR擴增要求。

3.2 法定基原重樓ITS序列的SNP位點分析及引物設計

在對65份不同產地的云南重樓樣本的ITS序列進行分析時，發(fā)現(xiàn)依據(jù)SNP位點可以劃分為2種基因型，二者在SNP上的多樣性表現(xiàn)為40個位點，分別編號為：YN-I 和YN-II，基因型具體劃分標準見表3。其中，YN-I型樣本有35份，YN- II型樣本有30份，為了避免漏檢其中之一基因型，出現(xiàn)云南重樓檢測的假陰性，需要同時設計兩個引物對。設計并命名鑒別七葉一枝花的特異性引物對H-F/H-R，鑒別云南重樓基因型I、II的特異性引物對YN-IF2/YN-IR2，YN-IIF3/YN-IIR21。引物序列由擎科梓熙生物科技有限公司合成。三對特異性引物序列見表2。

表2 引物序列表Table 2 Primers used in this study

表3 云南重樓兩類基因型的SNP位點特征Table 3 SNP site characteristics in two genotypes of P.polyphylla var.yunnanensis

3.3 多重PCR反應體系的建立及優(yōu)化

3.3.1 最適引物濃度的考察

設置三對特異性引物H-F/H-R，YN-IF2/YN-IR2，YN-IIF3/YN-IIR21的不同濃度比例，見表4。考察不同引物濃度對PCR擴增反應的影響，篩選最適引物濃度。通過調整引物用量，在保證特異性條帶亮度的同時削弱非特異性條帶，并綜合考慮節(jié)約引物用量，選擇引物濃度比例E。保證七葉一枝花在210 bp有一條明亮條帶，云南重樓基因型I(YN-I)在248 bp有一條明亮條帶，云南重樓基因型II(YN-II)在149 bp有一條明亮條帶，見圖1。

表4 引物濃度優(yōu)化條件Table 4 Optimal conditions of specific primers’ concentration

圖1 多重PCR體系引物濃度考察電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of primers concentration investigation注：M：DNA Marker，從上至下依次為：600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp；BC為空白對照，H為七葉一枝花，I為云南重樓(基因型YN-I)，II為云南重樓(基因型YN-II)，NC為近緣種多葉重樓陰性對照，下同。圖A、B、C、D、E、F中三引物對濃度比即為文中所述。Note：M：DNA Marker,from top to bottom,the following is:600 bp,500 bp,400 bp,300 bp,200 bp and 100 bp;BC is Blank control,H is P.polyphylla var. chinensis,I is P.polyphylla var.yunnanensis (YN-I),II is P.polyphylla var.yunnanensis (YN-II),NC is P.polyphylla var.polyphylla as the negative control,similarly hereinafter.The concentration of three specific primer pairs in figure A,B,C,D,E and F are as described in the article.

3.3.2 最適dNTP濃度的考察

dNTP濃度分別設置為120、200、280、400 μM，考察不同dNTP濃度對PCR擴增反應的影響，篩選最適dNTP濃度(圖2)。結果表明，dNTP隨濃度的增加，對多重PCR反應具有抑制作用。當dNTP濃度為120至280 μM時，可逐漸抑制非特異性條帶的產生；當濃度高于280 μM時，則會開始對特異性鑒別條帶產生抑制。因此，本研究選擇dNTP濃度為280 μM。

3.3.3 最適Taq酶用量的考察

25μL體系中Taq酶用量分別設置為0.5、1.5、2.5、3.5 U，考察不同Taq酶用量對PCR擴增反應的影響，篩選最適Taq酶用量(圖3)。結果表明，0.5至3.5 U的Taq酶均可擴增出特異性條帶，當用量達到1.5 U以上時，三條特異性條帶亮度較高，為了弱化非特異性條帶的擴增，本研究選擇Taq酶用量為1.5 U。

圖2 多重PCR體系dNTP濃度考察電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of dNTP concentration investigation注：圖A、B、C、D中dNTP濃度依次為120、200、280、400 μMNote：The concentration of dNTP in figure A,B,C and D are 120,200,280 and 400 μM

圖3 多重PCR體系Taq酶用量考察電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of Taq polymerase dosage investigation注：圖A、B、C、D中Taq酶用量依次為0.5、1.5、2.5、3.5 UNote：The dosage of Taq polymerase in figure A,B,C and D are 0.5,1.5,2.5 and 3.5 U

3.3.4 最適退火溫度的考察

分別設置退火溫度為60、62.4、64.3、66 ℃，考察不同退火溫度對PCR擴增反應的影響，篩選最適退火溫度(圖4)。結果顯示，溫度的升高可提高反應的特異性，但當退火溫度高達66 ℃時，特異性鑒別條帶亮度較弱，YN-I的特異性條帶甚至幾乎無法擴增。因此，綜合考慮退火溫度對三對特異性引物擴增效率的影響，選擇64 ℃為本體系的退火溫度。

圖4 多重PCR體系退火溫度考察電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of annealing temperature investigation注：圖A、B、C、D中退火溫度依次為60、62.4、64.3、66 ℃Note：The annealing temperature in figure A,B,C and D are 60,62.4,64.3 and 66 ℃

3.3.5 最適循環(huán)數(shù)的考察

分別選用26、27、28、30和32個循環(huán)進行考察，考察不同循環(huán)數(shù)對PCR擴增反應的影響，篩選最適擴增循環(huán)次數(shù)(圖5)。結果表明，26至32循環(huán)時均能擴增出三者的特異性鑒別條帶。為保證結果的準確性及避免因循環(huán)數(shù)過多導致可能的非特異性條帶擴增，選擇為27個循環(huán)進行PCR反應。

圖5 多重PCR體系循環(huán)數(shù)考察電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis of cycles investigation注：圖A、B、C、D、E中循環(huán)數(shù)依次為26、27、28、30、32Note：The cycles in figure A,B,C,D and E are 26,27,28,30 and 32

3.3.6 模板量的考察

對反應體系中模板DNA的用量進行了考察，分別設置10、30、60、90 ng的模板DNA用量(圖6)。結果表明，模板量在10～90 ng時均能擴增出特異性條帶，且隨著模板DNA的增加，擴增條帶的亮度呈遞增趨勢。

具體優(yōu)化結果見表5。

圖6 多重PCR體系模板量考察電泳圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of template quantity investigation注：圖A、B、C中樣品分別為H、I、II，每幅圖中模板量依次為10、30、60、90 ngNote：The samples in figure A,B and C are H,I and II.The template quantities in each figure are 10,30,60 and 90 ng

表5 多重PCR體系的優(yōu)化Table 5 Optimization of multiplex PCR identification system

續(xù)表5(Continued Tab.5)

優(yōu)化因素Optimization factors條件ConditionsHYN-IYN-IINC模板量Template quantity (ng)10+++-30+++-60+++-90+++-

注：“+”一條亮帶，“△”一條暗帶，“-”無條帶。
Note:“+” one bright band,”△” one dark band,”-” no band.

3.4 多重PCR特異性鑒別結果

采用上述所確定的最佳反應體系和反應參數(shù)，用法定基原種及8種常見的同屬近緣人工栽培品種對所建立的多重PCR鑒別體系進行方法適用性驗證(圖7)。結果顯示七葉一枝花樣本可擴增出片段大小為210 bp的特異性片段，云南重樓種下的兩類基因型(YN-I 、YN-II)樣本可分別擴增出248 bp和149 bp的特異性片段，同時得到了陽性鑒定，而其他同屬近緣種無任何片段，避免了干擾，易于直觀、準確的鑒別。

圖7 法定基原種及其常見的8種同屬近緣人工栽培種的多重PCR鑒別電泳圖Fig.7 Agarose gel electrophoresis of legal origins and their 8 closely related species from cultivated investigation注：M：DNA Marker，BC為空白對照，H為七葉一枝花，I為云南重樓(YN-I)，II為云南重樓(YN-II)，DY為多葉重樓，XY為狹葉重樓，N為南重樓，WZL為五指蓮，PF為平伐重樓，Q為球藥隔重樓，HZ為黑籽重樓，CZ為長柱重樓。Note：M:DNA Marker,BC is Blank control,H is P.polyphylla var. chinensis,I is P.polyphylla var.yunnanensis (YN-I),II is P.polyphylla var.yunnanensis (YN-II),DY is P.polyphylla var.polyphylla,XY is P.polyphylla var.stenophylla,N is P.vietnamensis,WZL is P.axialis var. axialis,PF is P.vaniotii,Q is P.fargesii,HZ is P.thibetica var.thibetica,CZ is P.forrestii.

4 討論

在多重PCR技術的適用性方面，該技術能夠實現(xiàn)在單個反應管中一次性檢測多個靶標的目的，相比普通PCR單個反應管中只能通過一對特異性引物檢測單個靶標的反應更加高效、經濟、快捷，在農作物[5-7]、動物[8,9]、微生物[10,11]和腫瘤細胞[12,13]等的鑒別中應用廣泛，也逐漸應用到金錢白花蛇[14]、人參、西洋參、三七[15,16]等中藥材的鑒別中。在靶序列的選擇方面，朱英杰[17]等用6種DNA 條形碼候選序列對重樓屬11個物種不同序列的鑒定能力進行評價，發(fā)現(xiàn)ITS2序列與其他 DNA 條形碼候選序列相比具有明顯的優(yōu)勢。姜黎[4]等對重樓屬8個物種4條DNA條形碼候選序列進行考察，認為ITS序列能夠鑒定重樓與其常見近緣種及飲片，顯示ITS序列適宜作為重樓屬下鑒定的靶序列。

在對65份云南重樓樣品進行測序時發(fā)現(xiàn)，云南重樓序列的種內差異較大，根據(jù)ITS序列的SNP可分為兩種類型。這也符合陳士林[18]《中藥DNA條形碼分子鑒定》中對4條長度為231bp的云南重樓DNA條形碼ITS2參考序列對比發(fā)現(xiàn)有27個變異位點的表述。因此，本研究首次提出云南重樓應該區(qū)分為兩類基因型：YN-I和YN-II，為了兼顧兩類基因型的云南重樓藥材的鑒別，避免假陰性結果，分別對兩類基因型的云南重樓設計特異性引物。

建立多重PCR擴增體系，引物的設計至關重要，尤其是同屬近緣種之間變異位點少，保證引物的特異性及引物之間相互不干擾是鑒別成功的關鍵[19]。本研究的引物的設計將針對重樓的法定基原七葉一枝花及兩種基因型的云南重樓分別設計三對特異性引物。為了保證引物特異性，本研究把引物YN-IIR21的5′端第八位和第十二位引入了錯配，將原本的核苷酸G和T突變?yōu)楹塑账酺和A，把引物H-F的3′端第二位的核苷酸G突變?yōu)锳，把引物H-R的3′端第二位的核苷酸T突變?yōu)锳，并且所有特異性引物的Tm值相差在4以內，以保證擴增效率一致。另外，相對于單一引物對PCR體系，在建立多重PCR擴增體系時，不同引物對的濃度比是影響多重PCR 特異性和穩(wěn)定性的關鍵因素，引物對之間存在相互競爭和互配關系，適宜的濃度比是多重PCR體系能穩(wěn)定擴增的關鍵因素[20]。在多基原中藥品種重樓同屬近緣種繁多的情況下，確定多重引物的濃度是本研究成功的重點及難點，本方法是經過多次試驗和條件優(yōu)化而確定最佳反應體系。

為了保證樣品基原的正確，本實驗在原植物形態(tài)學鑒定的基礎之上，對各樣本ITS序列的單一PCR擴增產物進行回收測序，并進行Genebank數(shù)據(jù)庫同源性比對分析，從而保證了樣品基原的準確性，為實驗結果的可靠性奠定了基礎。

同屬近緣種的混用情況一直是影響中藥材質量的一個重要因素，由于其外觀性狀及顯微結構相似，化學成分交叉重疊，導致鑒定困難[19]，重樓作為典型的“同屬多基原”品種更是如此。本實驗首次建立了重樓藥典法定基原與其同屬近緣種的多重PCR鑒別體系，該方法特異性高，適用性強，只通過一次PCR擴增即可準確、快速、可靠地鑒別七葉一枝花和云南重樓這兩種藥典法定重樓基原，并且能兼顧兩類基因型云南重樓藥材，避免假陰性，在重樓藥材和飲片的真?zhèn)舞b別，重樓人工栽培的種子種苗質量控制中值得推廣和應用。