尚瀟瀟，朱 琳，羅孝菁，饒 毅，唐 祥，張程瑞，蒲 祥

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，雅安 625014

喜樹(Camptothecaacuminata)，為我國特有二級野生保護植物，主要分布于中國長江流域及西南各省[1]。1966年由Wall等首次從樹皮中分離獲得喜樹堿(Camptothecin)[2]，其衍生物伊立替康、拓撲替康相繼被開發(fā)用于多種實體瘤如結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、惡性淋巴瘤等的臨床治療[3]，已成為抗腫瘤藥物市場上的主要品種之一，具有較大市場銷售額。喜樹因全株含有喜樹堿及喜樹堿類似物而受到持續(xù)關(guān)注，現(xiàn)已成為市場上喜樹堿及其衍生物產(chǎn)品獲取的主要植物資源之一[3]。此外，喜樹富含多種代謝產(chǎn)物，研究人員先后從喜樹的葉、果實、根、樹皮中發(fā)現(xiàn)了一百余種化合物，其中包括喜樹堿在內(nèi)的喹啉類生物堿以及吲哚類生物堿四十余種[4-7]，然而與日俱增的市場需求導(dǎo)致喜樹資源遭到破壞。

要實現(xiàn)喜樹資源的充分利用和探明代謝產(chǎn)物隨時間的變化規(guī)律，均需要對喜樹進行代謝產(chǎn)物輪廓分析。以甲基橙為顯色劑，楊磊等[8]構(gòu)建了喜樹中總生物堿的萃取光度法。余響華等[9]應(yīng)用乙醇浸提法優(yōu)化喜樹果中生物堿提取工藝。Montoro 等[10]以70%乙醇作溶劑對溫室培養(yǎng)喜樹葉進行代謝指紋分析，并從中鑒別了24種成分。在代謝組學(xué)分析中，提取溶劑和提取方法的選擇尤為重要。喜樹葉中代謝產(chǎn)物豐富，目前未見葉中總生物堿提取工藝優(yōu)化及抗菌抗氧化活性報道。由此我們以葉為研究對象，采用超聲冷提技術(shù)與響應(yīng)面分析法結(jié)合[11]，對喜樹葉中的總生物堿成分進行提取工藝優(yōu)化及抗菌、抗氧化活性測試，為進一步從喜樹葉中發(fā)掘活性生物堿奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

喜樹葉(樹體外圍新梢，枝頂端1～6位葉)取自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)，樹齡：大于十年，采集時間：2017年4月，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)楊瑞武教授鑒定為喜樹鮮葉(Camptothecaacuminataleaf)。喜樹堿對照品(上海阿拉丁試劑有限公司，中國)、2，2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS，C18H24N6O6S4)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，C18H12N5O6)、2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ，C18H12N6)、丁基羥基茴香醚(BHA，C11H16O2)、抗壞血酸(Vc，C6H5O6)均購自上海阿拉丁試劑有限公司；色譜純甲醇和乙腈(TEDIA，美國)；無水乙醇、甲醇、甲酸、三氯甲烷、甲基橙、石油醚、二甲亞砜均為分析純，購自成都科龍化工試劑廠； 0.22 μm和 0.45 μm針頭式過濾器(天津津騰實驗設(shè)備有限公司，中國)；無菌注射器(上海聚民生物科技有限公司，中國)；硫酸卡那霉素(生工生物工程(上海)股份有限公司，中國)； 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和枯草芽孢桿菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC(Agilent，美國)；Specord200Plus紫外可見分光光度計(Analytik Jena，德國)；BT124S電子天平(Sartorius，德國)；SB-5200 DTD 臺式超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司，中國)；TGL-16G高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠，中國)；DHG-9101 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司，中國)；PHS-3C 型酸度計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，中國)；IMS-50 型制冰機(常熟市雪科電器有限公司，中國)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司，中國)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(上海博訊醫(yī)療設(shè)備，中國)；ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城，中國)；移液槍(大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司，中國)。

2 實驗方法

2.1 樣品的前處理與提取

將新采集的喜樹葉鮮樣置于恒溫干燥箱25 ℃烘至恒重，粉碎過篩，即為喜樹葉干樣。干樣用石油醚浸泡脫色，烘干后樣品袋封裝-20 ℃保存?zhèn)溆?。喜樹葉樣品粉末0.50 g，加入適量提取溶劑后，超聲冷提(0 ℃)，提取液4 000 rpm離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入樣品瓶，并用提取溶劑定容至5 mL備用，得樣品液。

2.2 溶液配置

對照品溶液I：稱取喜樹堿對照品3.0 mg 于5 mL 容量瓶中，用適量DMSO溶解后乙醇定容，搖勻，配成0.6 mg/mL母液備用。檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液(pH 5)與1.5 mM甲基橙緩沖混合溶液的配置參照楊磊等[8]。

2.3 喜樹葉中總生物堿含量測定

總生物堿含量測定采用甲基橙顯色法[8]，以對照品濃度X為橫坐標、吸光度Y為縱坐標線性擬合，得回歸方程Y= 3.711 9X+0.036 1(R2= 0.992 5)?？偵飰A含量(mg/g)=樣品液中總生物堿濃度(mg/mL)×樣品液體積/喜樹葉干樣質(zhì)量(g)。

2.4 喜樹堿含量測定

對照品溶液II：將喜樹堿對照品母液I稀釋十倍，即得濃度為60 μg/mL喜樹堿對照品溶液II。喜樹堿含量測定使用Agilent 1260 Infinity高效液相色譜，色譜條件：色譜柱(InertSustain C18，4.6×250 mm，5 μm分離，柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min，G7129A自動進樣器進樣。流動相組成A：水+0.1%甲酸，B：甲醇；梯度洗脫程序：0～12 min，5%～50%(B)，12～30 min，50%～80%(B)，30～39 min，80%～98%(B)，39～45 min，98%～98%(B)；檢測波長：254 nm，373 nm。自動進樣器進樣，喜樹堿進樣量分別為60、300、600、3 000、6 000 ng，以喜樹堿進樣量X為橫坐標，色譜峰積分面積Y為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y= 3.73 861X+70.080 71 (R2=0.999 7)。

2.5 單因素實驗

以喜樹葉生物堿含量為指標，考察提取溶劑(甲醇：甲酸：水(甲醇比例)=12∶1∶7、15∶1∶4、18∶1∶1；甲醇：氯仿=4∶1、2∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4；乙腈：水=1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，固定料液比1∶10，提取時間30 min，超聲功率255 W)、提取時間(10、20、30、40、50 min，固定料液比1∶10，提取溶劑甲醇：甲酸：水=15∶1∶4，超聲功率255 W)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，固定提取時間30 min，超聲功率255 W，提取溶劑甲醇：甲酸：水=15∶1∶4)、超聲功率(120、165、210、255、297 W，固定提取時間30 min，料液比1∶10，提取溶劑甲醇：甲酸：水=15∶1∶4)以及甲醇比例(6∶1∶13、9∶1∶10、12∶1∶7、15∶1∶4、18∶1∶1，固定提取時間30 min，超聲功率255 W，料液比1∶10)5個因素對總生物堿含量的影響。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取料液比、超聲功率、甲醇比例為自變量，以總生物堿提取率為響應(yīng)值，利用Box-Benhnken中心組合設(shè)計3因素3水平試驗(見表1)。用Design Expert 8.0進行數(shù)據(jù)分析，最后通過模型驗證得出總生物堿超聲冷提最優(yōu)條件。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of RSM analysis

2.7 抑菌活性測試

參照藥品微生物測試方法[12]，用二倍稀釋法將樣品配制成一定濃度梯度1.0 mL樣品，選取硫酸卡那霉素作為陽性對照，M17.5F1W1.5溶液為陰性對照，每組平行測定3次。

2.8 抗氧化活性測定

2.8.1 總抗氧化能力的測定(FRAP法)

參照Benzie建立的方法，并稍作修改[13]。以M17.5F1W1.5溶液為空白對照，以BHA和Vc作為陽性對照，每組平行測定3次。以0.2～1.6 mmol/L的FeSO4的標準溶液測試并繪制標準曲線。樣品的總抗氧化能力以達到同樣吸光度所需的FeSO4的量表示[14]。

2.8.2 DPPH自由基清除活性

參照Brand-Williams建立的方法，并稍作修改[14]。以M17.5F1W1.5溶液為空白對照，BHA和Vc作為陽性對照，每組平行測定3次。清除率(RSA)計算公式如下：

式中：A0—M17.5F1W1.5溶液代替樣品測得的吸光度；A1—樣品、BHA或Vc的吸光度

2.8.3 ABTS自由基清除活性

參照Re建立的方法，并稍作修改[15]。以BHA和Vc作為陽性對照，每組平行測定3次。清除率(RSA)計算公式如下：

式中：A0—M17.5F1W1.5溶液代替樣品測得的吸光度；A1—樣品、BHA或Vc的吸光度

2.9 數(shù)據(jù)分析

所有試驗重復(fù)三次，實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 提取溶劑考察

以甲基橙法評估三種不同溶劑體系提取總生物堿收率，結(jié)果如圖1，MC體系收率最高，且隨溶劑比例變化影響顯著，MC比例為1∶1時(v/v)，總生物堿收率最高可達1.84±0.11 mg/g，但存在有色物質(zhì)干擾；MFW體系收率較為穩(wěn)定，保持在0.47±0.27 mg/g水平；AW體系溶劑比例顯著影響總生物堿收率，AW比例為3∶1(v/v)時收率最高0.50±0.01 mg/g。隨后對M1C1、M15F1W4、A3W1三種溶劑提取樣品進行HPLC對比分析，373 nm波長檢出色譜峰數(shù)M15F1W4(30個)>A3W1(25個)>M1C1(17個)，色譜峰強度M15F1W4>A3W1>M1C1，喜樹堿提取量M15F1W4>A3W1>M1C1，喜樹堿色譜峰面積占比A3W1(9.99%)> M1C1 (8.48%)>M15F1W4(7.28%)。由此可知，M15F1W4體系提取總生物堿種類更為豐富，故后續(xù)實驗選用MFW作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對總生物堿提取率的影響Fig.1 The yield of total alkaloids extracted with different extraction solvents

3.1.2 料液比考察

實驗結(jié)果如圖2A所示，總生物堿提取率隨溶劑用量增加逐漸增大，影響顯著，料液比達1∶20時，提取率最高可達0.88±0.03 mg/g，但繼續(xù)增加至1∶25時，總生物堿提取率略微下降。因此選擇1∶15、1∶20、1∶25進行響應(yīng)面分析。

3.1.3 超聲時間考察

如圖2B，總生物堿提取率隨超聲時間增長逐漸升高，10～40 min時，總生物堿提取率由0.43±0.03 mg/g升至0.71±0.02 mg/g，但超聲時間至20 min時，儀器開始產(chǎn)熱，增長至50 min時，超聲產(chǎn)熱嚴重，可能會破壞部分生物堿結(jié)構(gòu)，因此后續(xù)試驗超聲時間設(shè)定為40 min，并結(jié)合使用冰浴持續(xù)控溫。

3.1.4 超聲功率考察

結(jié)果如圖2C，超聲功率在一定程度影響總生物堿收率，總生物堿收率隨超聲功率升高而增高，升至255 W后達到最高值0.68±0.02 mg/g，繼續(xù)增加超聲功率，總生物堿收率不再繼續(xù)增加，可能樣品中生物堿已基本溶出，因此選擇210、255、297 W進行響應(yīng)面分析。

3.1.5 甲醇比例考察

結(jié)果如圖2D，MFW溶劑體系里甲醇比例對總生物堿收率存在影響，甲醇比例由30%升至75%時，生物堿收率逐漸上升，繼續(xù)升高甲醇比例，生物堿收率略微下降，可能跟葉中生物堿極性有關(guān)，甲醇比例為75%(M15F1W4)時，總生物堿收率為0.49±0.03 mg/g，因此，選擇甲醇比例為60%(12∶1∶7)，75%(15∶1∶4)，90%(18∶1∶1)進行響應(yīng)面分析。

圖2 料液比(A) 、超聲時間(B) 、超聲功率(C)、甲醇比例(D)對總生物堿提取收率的影響Fig.2 Effects of solid to liquid ratio(A),ultrasonic time(B),ultrasonic power(C),methanol ratio(D) on the yield of total alkaloids

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及分析

3.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

以單因素試驗為基礎(chǔ)，根據(jù)二次回歸組合試驗設(shè)計原理，以喜樹總生物堿含量為響應(yīng)值，設(shè)計料液比(A)、超聲功率(B)、甲醇比例(C)三個因素進行響應(yīng)面試驗(見表2)，試驗結(jié)果進行多元線性回歸擬合，得到喜樹葉總生物堿提取量對料液比(A)、超聲功率(B)、甲醇比例(C)的二次多項回歸方程：Y=1.62-0.091A+0.020B+0.28C+0.15AB-0.12AC-0.067BC-0.34A2-0.17B2-0.19C2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

3.2.2 回歸模型方差分析與顯著性檢驗

回歸模型方差分析使用Design-Expert 8.0，以確定三種因素對喜樹葉總生物堿提取率的影響程度和檢驗回歸方程有效性(見表3)。一次項A、C，二次項A2、B2、C2，交互項AB、AC、BC對喜樹總生物堿提取率的影響顯著，各因素與總生物堿提取率呈較明顯的二次拋物線關(guān)系，表明回歸方程擬合性較好，同時表明各交互因素在響應(yīng)值(總生物堿含量)存在最大值。分析方程方差可知，由總模型P<0.000 1可知本實驗所選取的二次多項式模型具有高度的顯著性；失擬項為0.050 4>0.05，表明失擬項不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.989 7，模型擬合度較好，此模型可在一定范圍內(nèi)用于分析和預(yù)測超聲輔助提取喜樹葉中總生物堿的效果。各因素影響大小順序為：甲醇比例(C)>超聲功率(A)>料液比(B)。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表3(Continued Tab.3)

方差源Source平方和Sum of squares自由度Df均方和Mean squareF值F valueP值P value顯著性SignificanceBC0.01810.0187.040.0328?A^20.5010.50197.42< 0.0001??B^20.1210.1245.430.0003??C^20.1610.1663.15< 0.0001??殘差Residual0.01872.533E-003---失擬項Lack of Fit0.01534.913E-0036.560.0504-純誤差Pure Error2.996E-00347.491E-004---總體Cor Total1.7216----

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.001)。
Note:*represented significant difference(P<0.05),**represented extremely significant difference(P<0.001).

3.2.3 交互作用分析

圖3A-B 顯示了超聲功率與料液比對喜樹中總生物堿提取量的交互作用，等高線呈橢圓形，且交互曲面陡峭，說明交互作用顯著，響應(yīng)值隨著超聲功率和料液比的改變先上升，后略微下降，存在最大值。圖3A-C 顯示了甲醇比例與超聲功率對喜樹中總生物堿提取量的交互作用，等高線呈橢圓形，甲醇比例與超聲功率之間的交互作用較為顯著。圖3B-C 顯示了甲醇比例與料液比對喜樹中總生物堿提取量的交互作用，等高線橢圓形，故甲醇比例與料液比之間的交互作用較為顯著。交互作用分析結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖3 各交互作用對總生物堿影響的響應(yīng)曲面(A-B、A-C、B-C)Fig.3 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on the yield of total alkaloids(A-B、A-C、B-C)

3.2.4 驗證試驗

由Design Expert 8.0軟件分析，得出喜樹葉中總生物堿提取的理論最優(yōu)條件為：超聲功率為239.25 W，甲醇：甲酸：水為17.64∶1∶1.36，料液比為1∶22.3 g/mL?？紤]到可操作性，將試驗條件修正為：超聲功率240 W，甲醇：甲酸：水為17.5∶1∶1.5，料液比為1∶22 g /mL，所得提取總生物堿的平均含量為1.67±0.08 mg/g(n=5)，與預(yù)測值1.75 mg/g 接近，相對誤差4.57%，表明優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定可行。

3.3 抑菌活性

抑菌活性測試表明，使用最優(yōu)條件提取制備的喜樹葉總生物堿提取物(LAE)對S.aureus、E.coli和P.aeruginosa具有抑菌效果，MIC值分別為4.38、8.75、8.75 μg/mL，對B.subtilis無明顯抑制效果，陰性對照MFW溶劑無抑菌活性，陽性對照卡那霉素抑菌活性強，具體結(jié)果見表4。

表4 總生物堿提取物對四種菌的最小抑制濃度(MIC),n=3Table 4 MIC of leaf total alkaloid extract(μg/mL),n=3

3.4 抗氧化活性測試

抗氧化活性測試結(jié)果見表5。LAE的質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL時，其FRAP值為5.062 ± 0.223 mM，而質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL 的BHA和Vc總抗氧化能力相近，其FRAP值分別為0.16 ± 0.01 mmol·L-1、0.16 ± 0.01 mmol·L-1。LAE、BHA、Vc對DPPH和ABTS自由基清除能力以半抑制濃度IC50表示，BHA與Vc對DPPH和ABTS自由基的清除能力基本相當(dāng)，而LAE對兩種自由基的清除能力比BHA和Vc強。

表5 總生物堿提取物抗氧化活性測試(μg/mL)，n=3Table 5 Antioxidant capability of the LAE(μg/mL),n=3

4 結(jié)論

自從喜樹中發(fā)現(xiàn)喜樹堿以來，人們長期致力于從喜樹中發(fā)掘新的喜樹堿類抗腫瘤活性成分，而忽視了對喜樹中其它生物堿類成分的開發(fā)與利用。本文以喜樹葉為對象首次開展超聲波冷提總生物堿，通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，確定最佳提取工藝為超聲功率240 W，甲醇：甲酸：水為17.5∶1∶1.5，料液比1∶22 g /mL，總生物堿的提取率為1.67±0.08 mg/g 。該法簡便易行，實用性較高，用途較廣。低溫提取確保了提取樣品中代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的完整性，響應(yīng)面優(yōu)化確保了提取樣品中生物堿類成分的多樣性。抗菌測試結(jié)果表明LAE具有較好的抑菌活性，對S.aureus、E.coli和P.aeruginosa三種菌株的MIC值分別為4.38、8.75、8.75 μg/mL。同時，LAE呈現(xiàn)優(yōu)于BHA和Vc的抗氧化活性，其FRAP值為0.16±0.01 mmol·L-1，對 DPPH和ABTS自由基清除半抑制濃度分別為4 μg/mL和3 μg/mL。本研究為喜樹葉中總生物堿的進一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。