楊 翠，趙錦花，王 強(qiáng)，楊衛(wèi)雪，李光開，扈雅寧

1長春師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，長春 130032； 2長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，延吉 133002

尾葉香茶菜Rabdosiaexcisa(Maxim.) Hera為唇形科香茶菜屬植物，屬于多年生草本植物，廣泛分布黑龍江、吉林及遼寧等省區(qū)[1,2]。主要生長于草叢、林中、林緣等陰生地帶。尾葉香茶菜全草入藥，性味苦涼，具有清熱解毒、健脾、活血等功效[3]。在民間，尾葉香茶菜被用于治療風(fēng)濕感冒、喉嚨腫痛、關(guān)節(jié)疼痛、蛇蟲咬傷等[4]。

目前，關(guān)于尾葉香茶菜的研究重點(diǎn)聚焦于水或醇提取物化學(xué)成分分離及藥理活性研究，且多為全草[5]。在中草藥開發(fā)中，尾葉香茶菜作為藥用植物的一員，在抗癌、抗腫瘤等研究中的價(jià)值越來越受到科研人員的關(guān)注。目前關(guān)于尾葉香茶菜揮發(fā)性成分的研究報(bào)道很少，且重點(diǎn)聚焦于尾葉香茶菜揮發(fā)性成分的定性分析[6-8]，及活性探究，并發(fā)現(xiàn)了揮發(fā)性成分具有降低血液中膽固醇濃度[7]、抑菌、抗氧化活性[8]等作用。關(guān)于尾葉香茶菜不同部位揮發(fā)性成分比較的相關(guān)研究未見報(bào)道，且尾葉香茶菜中已定性揮發(fā)性成分非常有限。為此，本研究采用氣流吹掃微萃取方法與GC-MS聯(lián)用對(duì)尾葉香茶菜揮發(fā)性成分開展系統(tǒng)性研究，利用化學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(主成分分析)比較其不同部位(根、莖、葉)揮發(fā)性成分的差異，為尾葉香茶菜的進(jìn)一步開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(島津，日本，GC-MS plus 2010)，100 μL襯管(安捷倫，美國)，AS20500AH型超聲波清洗器(天津AU-TOSCIENCE公司)，F(xiàn)W-100高速萬能粉碎機(jī)(天津泰斯特)，進(jìn)樣墊(島津，日本)，聚四氟乙烯管等。色譜純正己烷(Fisher，美國)。

1.2 材料

尾葉香茶菜于2016年8月采自吉林省長白山，將根、莖、葉分別剪切、洗凈后置于陰涼通風(fēng)處在自然條件下陰干。干燥的尾葉香茶菜用粉碎機(jī)粉碎，過200目篩，置于棕色樣品瓶中，-20 °C貯存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 揮發(fā)性成分的萃取

依據(jù)先前報(bào)道[9-11]，操作步驟如下：①準(zhǔn)確稱取粉碎的尾葉香茶菜植物樣品5.0 mg，放入樣品槽中，并安裝儀器；②取50 μL正己烷置于100 μL襯管(接收器)中；③打開開關(guān)開始萃取；④萃取后，利用正己烷定容至100 μL，隨后取2 μL進(jìn)樣分析。氣流吹掃微萃取條件：氮?dú)饬魉贋? mL/min,萃取溫度為250 °C,萃取時(shí)間為2 min，冷凝溫度為-4 °C。

2.2 揮發(fā)性成分的GC-MS分析

DB-5 MS毛細(xì)石英柱(30 m×0.25 mm ×0.25 μm)，載氣He (純度≥99.99%)，進(jìn)樣口溫度280 °C，進(jìn)樣量 2 μL，分流比50∶1,載氣流速為0.98 mL/min，升溫程序：45 °C保持1 min,4 °C/min升至250 °C， 6 °C/min升至280 °C，保持5 min。離子源EI,離子源溫度200 °C,電子能量70 eV。

利用島津化學(xué)工作站中NIST 10標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫進(jìn)行檢索，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)圖譜解析對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析。同時(shí)，應(yīng)用手動(dòng)積分方法對(duì)信噪比大于10的所有色譜峰進(jìn)行積分，并按面積歸一化法計(jì)算出各化學(xué)成分的相對(duì)含量，具體見附表1。

表1 尾葉香茶菜不同部位揮發(fā)性成分比較Table 1 Comparative of the volatile components from different parts of Rabdosia excise

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號(hào)No.時(shí)間Time化合物名稱Compound不同部位含量Content(%)根Root莖Stem葉Leaf189.3382-Oxo-2,5-dihydrofuran(2-[5H]-furanone)1.11.320.42199.433Unknown-40.661.130.59209.5572,5-Dimethylpyrazine0.200.070.07219.671Unknown-50.320.370.28229.911,2-Cyclopentanedione0.713.490.672310.206Unknown-60.050.10-2410.281Unknown-70.070.100.062510.3885-Methyl-2(5H)-Furanone0.110.220.152610.8863-Hydroxy-4,4-dimethyldihydro-2(3H)-furanone0.260.110.12711.0995-Methyl-2-Furanmethanol0.250.180.082811.222,3-Dimethyl-2-cyclopenten-1-one0.110.210.062911.4385-Methyl-2-furaldehyde3.750.600.33011.507Benzaldehyde0.530.420.343111.625Propanoic acid, 1-methylpropyl ester-0.410.113211.742(3E)-3-Methyl-3-hepten-2-one-0.120.113311.852-Methyl-2-butenolide-0.230.123411.8765-Hydroxymethyldihydrofuran-2-one0.16--3512.132Phenol0.311.381.673612.279.alpha.-Methylstyrene0.15--3712.2921-Octen-3-ol-5.753.133812.5662H-Pyran-2,6(5H)-dione0.150.450.173912.6642-n-Pentylfuran0.06--4012.759Acetic acid furfurylester0.060.50-4112.9Unknown-8-0.62-4212.9542,2-Diethyl-3-methyl-1,3-oxazolidine3.79--4313.3982-Formylpyrrole1.10.470.444413.5(E,E)-2,4-Heptadienal-0.170.24513.542Unknown-9-0.07-4613.725Unknown-10-0.160.264713.8293-Methyl-1,2-cyclopentanedione0.241.490.84814.175Unknown-110.20.280.144914.342Benzenemethanol-0.420.545014.7162-Methoxy-5-methylthiophene1.13--5114.75Benzeneacetaldehyde-0.170.245214.975Unknown-12-0.21-5315.05Unknown-13-0.76-5415.094-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)furanone0.44--5515.4292-Acetylpyrrole0.530.350.16

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號(hào)No.時(shí)間Time化合物名稱Compound不同部位含量Content(%)根Root莖Stem葉Leaf5615.588Hypnone0.560.360.195715.6923-Methyl-2,5-Furandione4.45--5815.7832-(4-Methylcyclohexyl)ethanol-0.170.065915.93-Methylcyclohexanone-0.330.256016.0062,5-Furandicarboxaldehyde0.30--6116.1052-Furyl hydroxymethyl ketone0.370.620.176216.3422-Methoxy-Phenol2.013.250.976316.523-Ethyl-2-hydroxy-2-cyclopenten-1-one0.222.140.896416.7762-Methyl-1,3-cyclohexanedione0.23-0.116516.8333-Ethenyl-3-methylcyclopentanone-2.840.466617.017Linalool-1.190.436717.0512,6-Pyridinediol0.23--6817.202Maltol1.270.730.526917.3334,5-Dimethyl-2-cyclohexen-1-one-0.18-7017.417Benzeneethanol-0.550.917117.779N-methyl-2-formylpyrrole0.13--7217.882Pentanoic acid, pentyl ester--0.327317.892Unknown-14-0.31-7418.196Unknown-150.19--7518.2744-Vinylcyclohexanone-0.340.187618.7671,3-Dimethyltetrahydro-2(1H)-pyrimidinone-0.440.547718.917Unknown-16-0.22-7820.125Unknown-17-0.640.37920.3331,2-Benzenediol0.672.511.38021.35Dihydrobenzofuran-0.521.68121.5745-Hydrxoymethylfurfural1.850.39-8221.705Unknown-180.070.16-8322.534Picolinamide0.11--8422.6662-Hydroxy-4-methylphenol0.121.100.228523.3462,6-Dihydroxyacetophenone0.301.310.478623.8531,7,7-Trimethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl acetate0.27--8724.042Indole--0.488824.6784-Hydroxy-2-methylacetophenone3.523.433.318925.8952,6-Dimethoxy phenol1.135.782.289026.1123-Allyl-2-methoxyphenol0.550.240.639126.242Unknown-19--0.339226.94-Ethyl-1,2-benzenediol-1.241.379327.5124-hydroxy-3-methoxy-Benzaldehyde3.452.410.31

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號(hào)No.時(shí)間Time化合物名稱Compound不同部位含量Content(%)根Root莖Stem葉Leaf9428.767Unknown-20--0.909529.231cis-Isoeugenol3.741.150.209629.583Unknown-21--0.179729.733Unknown-22--0.199830.1246-Methoxy-3-methylbenzofuran1.01--9930.25(3E)-4-(2,6,6-Trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-3-buten-2-one--0.5710030.2781-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-ethanone0.760.470.1210130.358Unknown-23--0.2910231.2584a-Methyl-4,4a,5,6,7,8-hexahydro-2(3H)-naphthalenone--0.07103Unknown-24--0.110431.565Guaiacylacetone0.651.740.4410531.7584,5,7,7a-Tetrahydro-4,4,7a-trimethyl-2(6H)benzofuranone--0.3910632.6693,5-Dimethoxyacetophenone0.921.660.1410732.925Unknown-25--0.2910833.256Di(sec-butyl) 2-methylsuccinate0.540.430.1410933.3342-Amino-1-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethanone0.660.11-11033.526Diethyl Phthalate0.350.310.3211133.731Unknown-260.290.280.1311233.882Unknown-270.23--11333.9712,6,10,15-Tetramethylheptadecane0.210.260.1311434.5612,4a,5,8a-Tetramethyl-1,2,3,4,4a,7,8,8a-octahydro-1-naphthalenyl acetate3.12-0.2611535.05Unknown-28--0.0911635.377Syringaldehyde1.040.58-11735.558Unknown-29--0.1811835.8Unknown-30--0.2511935.942Unknown-31--0.2212036.308Unknown-32--0.2512136.6482,6-Dimethoxy-4-allylphenol1.681.440.1712237.5333-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-Propenal12.613.340.2512337.6224-((1E)-3-Hydroxy-1-propenyl)-2-methoxy-phenol0.611.11-12437.993Unknown-330.31--12538.339Unknown-340.150.240.0412638.525Unknown-35-0.210.2812740.447(2E)-3,7,11,15-Tetramethyl-2-hexadecen-1-ol2.752.8117.8112840.592Unknown-36-0.340.9312940.982Diisobutyl phthalate0.760.520.4113041.083Unknown-37-0.433.1813141.541Unknown-381.011.006.94

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號(hào)No.時(shí)間Time化合物名稱Compound不同部位含量Content(%)根Root莖Stem葉Leaf13243.217Unknown-39--0.2613343.361Dibutyl phthalate0.650.480.2113443.6Palmitic acid-0.250.7713543.8243,5-Dimethoxy-4-hydroxycinnamaldehyde1.681.04-13646.525Nonadecanol--0.9613746.825Methyl linolenate--0.8113847.065Phytol1.161.697.0313947.8Unknown-40--7.3614048.367Unknown-41--0.6814151.067Behenic alcohol--0.3514251.6Unknown-42-0.580.714352.45Unknown-43--0.4114454.533Unknown-44--0.2414555.508Unknown-45-0.49-14657.85Unknown-46-0.41-14758.825Unknown-47--0.3514860.437Spinacene1.110.542.414961.83n-Hexatriacontane0.60.881.58

注：-未檢出。
Note: -not deteated.

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用主成分分析(PCA)方法，利用SPSS Statistics統(tǒng)計(jì)軟件完成。

3 結(jié)果與討論

3.1 尾葉香茶菜中揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分分析

尾葉香茶菜中共檢測出149個(gè)色譜峰，根、莖、葉分別檢測到86、97、106個(gè)。與標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對(duì)，已定性成分各占總成分的93.66%、88.05%、72.62%，尾葉香茶菜中共有102個(gè)峰被定性。各部位揮發(fā)性成分的GC-MS分析的總離子流程圖結(jié)果見圖1。采用數(shù)據(jù)處理中的手動(dòng)積分法對(duì)每個(gè)峰進(jìn)行積分處理，以峰面積歸一化法測得其中各組分相對(duì)百分含量。具體信息見附表1。

圖1 尾葉香茶菜不同部位揮發(fā)性成分總離子流程圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile components in different parts of Rabdosia excise (Maxim.) Hera

文獻(xiàn)報(bào)道，尾葉香茶菜揮發(fā)性成分提取方法有CO2超臨界萃取法[6,8]、水蒸氣蒸餾法[7]，兩種方法定性揮發(fā)性成分分別為15和34種，本文采用氣流吹掃微萃取法定性揮發(fā)性成分102種。從樣品消耗量方面考慮以往方法一般需200 g左右[8]，氣流吹掃微萃取法僅需5.0 mg。另外，以往方法至少需要60 min萃取時(shí)間[8]，而氣流吹掃微萃取法僅需2 min。綜合上所述，中草藥揮發(fā)性成分定性分析推薦采用氣流吹掃微萃取法。

3.2 不同部位化學(xué)組成比較研究

從色譜的總離子流圖可知，尾葉香茶菜的各部分均檢測到多種揮發(fā)性成分，但從總離子流圖中很難直觀區(qū)分三者的差異。另外，即使經(jīng)檢索、解析和文獻(xiàn)比對(duì)，確認(rèn)每種成分，但仍難以從成分和含量信息中直觀區(qū)分三者。為此，本文分別采用化學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行比較分析。

3.2.1 按不同官能團(tuán)比較分析

解析已定性成分的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)所有揮發(fā)性成分都是C4～C36的化合物，涉及化合物類型包含醇類、酮類、醛類、酯類、酚類、酸類等。為此，將所有成分依據(jù)化合物所含官能團(tuán)共分12類。從圖2可知，根中含量最多的成分是醛類(37.5%)，其次是酮類(12.9%)、其他含N-、O-類(12.4%)及酚類(10.8%)；葉中最多成分為醇類(33.9%)，其次是酮類(10.5%)和酚類(8.81%)；莖中酮類(23.3%)、醇類(19.7%)、酚類(19.2%)三類組分相差不多，其次是醛類(14.9%)。分析結(jié)果顯示尾葉香茶菜根、莖、葉中揮發(fā)性物質(zhì)的組成類型有明顯差異。

圖2 尾葉香茶菜不同部位化學(xué)成分官能團(tuán)分類比較Fig.2 Comparison of functional groups of chemical components in different parts of Rabdosia excise (Maxim.) Hera

3.2.2 主成分(PCA)分析

為了更直觀的辨別尾葉香茶菜不同部位之間是否存在實(shí)質(zhì)性差異，本文采用PCA統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行比較，分別以58個(gè)共用成分及全部成分的官能團(tuán)分類數(shù)據(jù)作為變量，具體結(jié)果見圖3和圖4。在圖3中第一個(gè)主成分(X-axis：PC1)占57.6%，第二個(gè)主成分(Y-axis：PC2)占29.8%。在圖4中第一個(gè)主成分(X-axis：PC1)占64.0%，第二個(gè)主成分(Y-axis：PC2)占29.6%。在兩種作圖方式中，所選擇的兩個(gè)主成分之和占總變量的比例均大于85%。兩種變量的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果均清晰顯示尾葉香茶菜的三個(gè)部位揮發(fā)性成分有明顯差異。通過分析可知每一部位的主要貢獻(xiàn)成分，根中主要貢獻(xiàn)成分是醛類、酮類、其他含N-、O-類及酚類；莖中主要貢獻(xiàn)成分是酮類、醇類和酚類；葉中主要貢獻(xiàn)成分則是醇類、酮類和酚類。該結(jié)果顯示，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可以將復(fù)雜的藥用植物揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)據(jù)簡單化，可直觀顯示部位之間的異同，這說明統(tǒng)計(jì)學(xué)方法有望應(yīng)用于香茶菜屬植物種類之間的鑒別，下一步將開展相關(guān)研究，希望能夠?yàn)樗幱弥参镩g的鑒別提供一種科學(xué)、直觀的方法。

圖3 共有成分主成分分析圖Fig.3 PCA diagram of common component

圖4 全部成分的官能團(tuán)分類主成分分析圖Fig.4 PCA diagram of functional group classification of all components

4 結(jié)論

本文研究結(jié)果顯示采用氣流吹掃微萃取技術(shù)可從尾葉香茶菜中萃取到更多的揮發(fā)性成分，而更多的成分信息可為后續(xù)尾葉香茶菜的深入研究提供基礎(chǔ)。研究結(jié)果說明統(tǒng)計(jì)方法可應(yīng)用于植物揮發(fā)性成分的比較中，并將其結(jié)果與化學(xué)方法相結(jié)合，能夠更加直觀準(zhǔn)確的說明尾葉香茶菜不同部位中揮發(fā)性成分存在差異及各部位主要貢獻(xiàn)成分。本文對(duì)尾葉香茶菜不同部位揮發(fā)性成分的比較研究將為尾葉香茶菜的進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。