侯冠雄，王永江，張周鑫，顏一軍，馬亞團(tuán)，朱艷玲，黃勝雄*

1云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，昆明 650500；2中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；3昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院，昆明 650106；

白蘭(MicheliaalbaDC.)，又名黃桷蘭、白緬桂、把蘭等，屬木蘭科含笑屬的常綠喬木，原產(chǎn)于印度尼西亞的瓜哇島，現(xiàn)已廣泛分布于我國的西部和東南部[1]。白蘭不但樹形好，花期長，葉色濃綠，且白蘭花、葉、莖中都含有揮發(fā)性芳香物質(zhì)，少有病蟲害侵?jǐn)_，四季呈香，是珍貴的觀賞性芳香植物。白蘭花性溫，味苦辛，具有止咳、化濁的功效，民間用作驅(qū)蚊防蟲劑。白蘭花潔白清香，可提制成白蘭花浸膏，供高檔化妝品作為香精之用，還是我國熏制花茶的重要原料之一[2]。鮮葉可提取香油，又稱“白蘭葉油”，其對(duì)慢性支氣管炎有很好的功效，且根皮可入藥，用于治療便秘[3]。

現(xiàn)如今，已有大量國內(nèi)外學(xué)者對(duì)白蘭花揮發(fā)油成分進(jìn)行了研究[4-9]，大都是采用溶劑萃取和固相微萃取等方法，并結(jié)合GC-MS分析白蘭花揮發(fā)油成分。白蘭具有抗癌和皮膚保護(hù)的藥理作用[10]，但對(duì)其抗蟲和抑菌活性研究相對(duì)甚少[11]，本文將對(duì)此方面進(jìn)行研究探討，涉及的供試菌為4株細(xì)菌，4株真菌；供試蟲為粘蟲(Mythimnaseparata)[12-16]。粘蟲屬鱗翅目，夜蛾科，又名行軍蟲或剃枝蟲，危害玉米、小麥和水稻等主要糧食作物以及其它100多種作物，其可將作物的葉片吃光并能咬斷麥穗或谷穗，使作物嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)，損害農(nóng)民利益。本文研究發(fā)現(xiàn)白蘭揮發(fā)油對(duì)水稻黃單胞菌和水稻紋枯病菌抑制效果較好，并且對(duì)粘蟲(M.separata)也有一定抑制作用，這為白蘭花揮發(fā)油的綜合利用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料與取樣方法

供試材料：白蘭花，2016年采自四川省邛崍市孔明鄉(xiāng)，該植物由中國科學(xué)院昆明植物研究所吳之坤高級(jí)工程師鑒定。標(biāo)本(KIB1201)保存于中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源可持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

受試?yán)ハx：粘蟲Mythimnaseparata(Walker)幼蟲，從濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司購入。本實(shí)驗(yàn)選取健康，大小一致，發(fā)育正常的2～3齡粘蟲幼蟲。

1.1.2 菌種及培養(yǎng)基

菌株：大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 8099)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)和枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)購買自ATCC菌種庫；水稻黃單胞菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzaeRS105)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、大豆根腐致病菌(Fusariumoxysporum)、玉米彎孢致病菌(Curvularialunata(Walk) Boed)和水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)由西北農(nóng)林科技大學(xué)馬亞團(tuán)老師提供。菌株目前保藏于植物化學(xué)與西部植物資源可持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

PDA培養(yǎng)基：200.0 g去皮土豆切碎后，加入1.0 L自來水，煮沸30 min，四層紗布過濾后，濾液加入技術(shù)瓊脂粉20.0 g，右旋葡萄糖20.0 g，定容至1.0 L，自然pH。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉 10.0 g/L，技術(shù)瓊脂粉20.0 g/L，pH = 7.4。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器條件

主要儀器：電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司，中國)，恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司，中國)，德國科恩KERN ABS系列萬分之一分析天平，YXQ-LS-18SI 高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，中國)，使用的揮發(fā)油提取器，圓底燒瓶，冷凝管的廠家均為中國四川蜀玻(集團(tuán))有限責(zé)任公司。使用的試劑丙酮、甲醇、無水硫酸鈉均為分析純，由中國天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器為美國Agilent Technologies公司HP6890GC/5973MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

GC條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；柱溫：起始溫度40 ℃，程序升溫3 ℃/min至80 ℃，再程序升溫5 ℃/min至280 ℃，保持20 min；柱流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱前壓100 kPa；分流比30∶1；進(jìn)樣量0.1 μL；載氣為高純氦氣。MS條件：電離方式EI；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量范圍35～500 amu。

1.2 方法

1.2.1 白蘭花揮發(fā)油的提取與鑒定

采用水蒸氣蒸餾法[19]提取白蘭花揮發(fā)油。采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器進(jìn)行分離分析，采用Wiley7n.l標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索定性。

1.2.2 得率計(jì)算

白蘭花揮發(fā)油提取率 = (M-M0) / 100×100%

其中，M(g)為揮發(fā)油連同容器重量；M0(g)為干燥容器重量。每次實(shí)驗(yàn)樣品用量100.0 g。

1.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)[17]

將凍存在20%甘油中的植物病原真菌接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃避光培養(yǎng)4天，細(xì)菌接種到液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 rpm避光培養(yǎng)12 h。將揮發(fā)油用丙酮稀釋成5個(gè)濃度(0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5 mL/mL)待用。將活化好的植物病原真菌孢子接種到約45 ℃的PDA培養(yǎng)基并倒入培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后待用。取液體LB培養(yǎng)好的細(xì)菌菌液，將其接種到約45 ℃的固體LB培養(yǎng)基并倒入到培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后待用。在無菌濾紙片(用打孔器將濾紙片加工成直徑為6 mm)中心滴加5 μL丙酮稀釋的待測(cè)樣品，待溶劑揮干后，將其放置在已接菌的培養(yǎng)基中。每塊平板均以丙酮作為陰性對(duì)照，真菌以放線菌酮和制霉菌素作為陽性對(duì)照，細(xì)菌以卡那霉素作為陽性對(duì)照。植物病原真菌在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察抑菌圈大小，細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后觀察抑菌圈大小，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，求其平均值。

1.2.4 拒食活性測(cè)定[18]

采用小葉碟添加法。挑選大小均一、生命力較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)粘蟲，隔離于錐形瓶中，保持其饑餓狀態(tài)6～8 h后，取出并將其置于潔凈的培養(yǎng)皿中。將采摘的新鮮玉米葉裁剪成邊長為1 cm的正方形葉碟，將其浸泡于上述用丙酮稀釋好的揮發(fā)油中，2～3 s后取出，待溶劑揮干后，置于放有試蟲的培養(yǎng)皿內(nèi)。對(duì)照組使丙酮溶液作對(duì)照用相同方法處理。分別在6、12、24、48 h用坐標(biāo)方格紙測(cè)量拒食面積并計(jì)算拒食率，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，求其平均值。公式如下：拒食率(%) = [(對(duì)照組取食面積-處理組取食面積)/對(duì)照組取食面積]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 白蘭花中揮發(fā)油成分的總離子流圖

2.2 揮發(fā)油化學(xué)成分分析

對(duì)白蘭花揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析，采用Wiley7n.l標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索定性，其結(jié)果見表1。

表1 白蘭花揮發(fā)油的化學(xué)物質(zhì)組成和百分比含量Table 1 The chemical composition and percentage content of essential oils from flowers of M.alba DC

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號(hào) No.化合物 Compounds分子式 Molecular formula分子量 Molecular weight相對(duì)分子含量 Relative molecular content (%)22β-SelineneC15H242041.67723α-MuuroleneC15H242040.31624β-BisaboleneC15H242041.99925δ-CadineneC15H242041.83326α-CalacoreneC15H202000.45427β-CalacoreneC15H202000.11628Caryophyllene oxideC15H24O2206.09729γ-CadineneC15H242040.2403012-Oxabicyclo[9.1.0]dodeca-3,7-diene,1,5,5,8-tetramethyl-,(1R,3E,7E,11R)C15H24O2201.672311,5-Epoxy salvial-4(14)-eneC15H24O2200.11132Naphthalene,1,2,4a,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-C15H242040.11133Bicyclo[5.2.0]nonane,4-methylene-2,8,8-trimethyl-2-vinyl-C15H242040.11234Tricyclo[5.2.2.0(1,6)]undecan-3-ol,2-methylene-6,8,8-trimethyl-C15H24O2200.03735α-Cedrene oxideC15H24O2200.438361,6-Dimethyl-4-(1-methylethyl)-(1,2,3,4,4a,7)hexahydronaphthaleneC15H242040.48937cis-β-FarneseneC15H242040.466Alcohols38cis-Linalool oxide (furanoid)C10H18O21701.84739trans-Linalool oxide (furanoid)C10H18O21701.66940LinaloolC10H18O15443.18041HotrienolC10H16O1520.34542BenzeneethanolC8H10O1220.09643trans-Linalool oxide (pyranoid)C10H18O21700.12744cis-Linalool oxide (pyranoid)C10H18O21700.087454-TerpineolC10H18O1540.05046α-TerpineolC10H18O1540.17347GeraniolC10H18O1540.10148NerolidolC15H26O2220.66349tau-MuurololC15H26O2221.58350Selin-11-en-4α-olC15H26O2220.592516-Isopropenyl-4,8a-dimethyl-1,2,3,5,6,7,8,8a-octahydro-naphthalen-2-olC15H24O2201.00052Epi-CubebolC15H242040.32753(+) SpathulenolC15H24O2200.37254Epi-EudesmolC15H26O2220.818Hydrocarbon552-UndecanoneC11H22O1700.03356NonadecaneC19H402680.03157HeneicosaneC21H442970.04858TricosaneC23H483250.068

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號(hào) No.化合物 Compounds分子式 Molecular Formula分子量 Molecular weight相對(duì)分子含量 Relative molecular content (%)59PentacosaneC25H523530.033608-HexadecyneC16H302220.223Other612-Methylbutyric acidC5H10O21020.05662p-CymeneC10H141340.11063BomeolC10H18O1540.10764p-AllylanisoleC10H12O1480.10965SafroleC10H10O21620.05466Methyl anthranilateC8H9NO21510.06067Methyl isoeugenolC11H14O21783.54068MethyleugenolC11H14O21783.54692(1H)Naphthalenone,3,5,6,7,8,8a-hexahydro-4,8a-dimethyl-6-(1-methylethenyl)C15H22O2180.18570Lilac aldehyde AC10H16O21680.04871Lilac aldehyde BC10H16O21680.086724,7-Methanobenzofuran,2,2-oxybis[octahydro-7,8,8-Trimethyl-,[2S-[2a(2R?,3aS?,4R?,7R?,7aS?),3aa,4a]C24H38O33740.226732,5-Cyclohexadiene-1,4-dione,2,6-bis(1,1-dimethylethyl)C14H20O22200.139742-(4a,8-Dimethyl-6-oxo-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydro-naphthalen-2-yl)-propionaldehydeC15H22O22340.038759,12,15-(Octadecatrienoic acid,methyl ester,(Z,Z,Z)C19H32O22920.339767,7′-(Bi(bicyclo[2.2.1]heptan)-7(7')-ene)C14H201880.347總計(jì)Total93.026

表1中列出了從白蘭花揮發(fā)油中鑒定出的76個(gè)化合物，主要為單萜和倍半萜。本次檢測(cè)出的化合物占總揮發(fā)油的93.026%，主要成分有芳樟醇(43.180%)、石竹烯氧化物(6.097%)、β-欖香烯(3.068%)、甲基丁香酸(3.540%)、β-石竹烯(3.409%)、β-紅沒藥烯(1.999%)、順-呋喃型芳樟醇氧化物(1.847%)、δ-杜松烯(1.833%)、β-芹子烯(1.677%)、tau-木羅醇(1.583%)、α-胡椒烯(1.419%)和大香葉烯D(1.258%)等。

2.3 抑菌活性測(cè)定

用濾紙片法，測(cè)定純揮發(fā)油及5種不同濃度揮發(fā)油的抑菌活性，其結(jié)果見表2、表3。白蘭花揮發(fā)油對(duì)指示細(xì)菌和植物病原真菌都具有一定抑制作用，其中，純揮發(fā)油抑制效果最佳。白蘭花揮發(fā)油對(duì)枯草芽孢桿菌和水稻黃單胞菌具有較好的抑制作用，在濃度為0.0125 mL/mL時(shí)，都能對(duì)這兩株指示細(xì)菌具有抑制作用。此外，白蘭花揮發(fā)油在高濃度時(shí)對(duì)植物病原真菌具有很好的抑制作用，在低濃度時(shí)對(duì)植物病原真菌的抑制作用相對(duì)較弱。

2.4 拒食活性測(cè)定

采用葉碟法，測(cè)定5種不同濃度的白蘭花揮發(fā)油對(duì)粘蟲幼蟲的拒食活性，其結(jié)果見表4。

表4顯示，不同濃度白蘭花揮發(fā)油對(duì)粘蟲幼蟲具有一定的拒食作用。當(dāng)白蘭花揮發(fā)油濃度大于0.l mL/mL時(shí)，供試蟲不取食，拒食率接近100%；當(dāng)濃度小于0.05 mL/mL時(shí)，隨著時(shí)間的推移粘蟲表現(xiàn)出波浪型拒食特性，即某一段時(shí)間拒食率較高，某一段時(shí)間拒食率低。總體而言，白蘭花揮發(fā)油對(duì)粘蟲幼蟲表現(xiàn)出較強(qiáng)拒食活性，取當(dāng)濃度為0.1 mL/mL的白蘭花揮發(fā)油處理葉片48小時(shí)后，仍具有80%的拒食率。

3 結(jié)論

本論文利用傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油得率為4.18%，雖耗時(shí)長，但所提取的揮發(fā)油外觀佳，抑菌和拒食活性好。而后通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析白蘭花中揮發(fā)油的成分，共鑒定出76個(gè)成分，總含量占揮發(fā)油的93.026%。白蘭花揮發(fā)油中的香氣成分主要為芳樟醇，其次石竹烯氧化物、甲基丁香酸、β-石竹烯等，這些成分構(gòu)成了白蘭特有的香味。通過與文獻(xiàn)[19,20]報(bào)道的揮發(fā)油對(duì)比，發(fā)現(xiàn)白蘭花的揮發(fā)油化學(xué)成分與采摘時(shí)間和提取方法有關(guān)，并且與白蘭葉和莖的揮發(fā)油成分存在差異，但其主要成分大體相同，所以白蘭花揮發(fā)油也具有白蘭葉和莖揮發(fā)油相似的功效。

表2 純揮發(fā)油及不同濃度白蘭花揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性(抑菌圈的直徑，mm)Table 2 The antibacterial activity of essential oils from flowers of M.alba(The diameter of inhibition zone,mm)

注：丙酮稀釋后的5個(gè)濃度(0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 mL/mL)的揮發(fā)油分別與1、2、3、4、5對(duì)應(yīng)。表中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值。
Note:The five kinds of essential oils diluted by acetone (0.2,0.1,0.05 ,0.025,0.0125 mL/mL) correspond to 1,2,3,4,5.Date given were from 3 duplicates.

表3 純揮發(fā)油及不同濃度白蘭花揮發(fā)油的抗真菌活性(抑菌圈的直徑，mm)Table 3 The antifungal activity of essential oils from flowers of M.alba.(The diameter of inhibition zone,mm)

注：丙酮稀釋后的5個(gè)濃度(0.2 mL/mL，0.1 mL/mL，0.05 mL/mL，0.025 mL/mL，0.0125 mL/mL)的揮發(fā)油分別與1，2，3，4，5對(duì)應(yīng)。表中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值。
Note：The five kinds of essential oils diluted by acetone (0.2 mL/mL,0.1 mL/mL,0.05 mL/mL,0.025 mL/mL,0.0125 mL/mL) correspond to 1,2,3,4,5.Date given were from 3 duplicates.

表4 白蘭花揮發(fā)油對(duì)粘蟲的拒食活性測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of resist food effect of essential oils from flowers of M.alba DC.on Mythimna separata

從白蘭花揮發(fā)油抑菌效果來看，白蘭花揮發(fā)油對(duì)枯草芽孢桿菌和水稻黃單胞菌具有較好的抑制作用，在濃度為0.012 5 mL/mL時(shí)，都能對(duì)這兩株指示細(xì)菌具有抑制作用。此外，白蘭花揮發(fā)油在高濃度時(shí)對(duì)植物病原真菌具有很好的抑制作用，在低濃度時(shí)對(duì)植物病原真菌的抑制作用相對(duì)較弱。

綜上所述，通過水蒸氣提取白蘭花揮發(fā)油，雜質(zhì)較少，整體外觀好；從白蘭花揮發(fā)油對(duì)不同菌種的抑菌實(shí)驗(yàn)中可知，對(duì)細(xì)菌和真菌都具有一定的抑制作用，尤其是對(duì)水稻黃單胞菌和水稻紋枯病菌抑制效果最好；白蘭花揮發(fā)油對(duì)粘蟲抗蟲性試驗(yàn)可知，白蘭花揮發(fā)油在特定濃度下有很高的拒食率，從而使揮發(fā)油對(duì)粘蟲幼蟲具有較好的抑制作用。故而，白蘭花揮發(fā)油在農(nóng)作物生產(chǎn)以及植物病害防治上具有一定的應(yīng)用前景。