劉 倩 馮 琴 胡義揚(yáng) 李 爽

1.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科 (上海, 201900)；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)目前是世界范圍內(nèi)廣泛出現(xiàn)的一個(gè)健康問題，影響到全球總?cè)丝诘?5%～30%[1]。它包括非炎癥性單純脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)，是與胰島素抵抗(IR)以及遺傳易感密切相關(guān)的代謝性疾病。NAFLD患者2型糖尿病、心血管危險(xiǎn)因素相關(guān)的死亡風(fēng)險(xiǎn)增加，而NASH患者也由于可能進(jìn)展為肝硬化和HCC而增加了肝臟相關(guān)的死亡率。在亞洲NAFLD患者中，有肝活檢證實(shí)的NASH患病率為63.45%[2]。隨著社會發(fā)展與生活習(xí)慣的改變，NAFLD在我國患病率也進(jìn)入一個(gè)快速增長期，2016年我國NAFLD發(fā)病率為5%～24%[3]。雖然限制熱量攝入、強(qiáng)化運(yùn)動或減肥手術(shù)等仍是目前治療方案的最重要部分，但仍沒有效果確切的可推薦的干預(yù)措施，因此，發(fā)現(xiàn)并研究安全有效的NAFLD治療藥物仍具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。京尼平苷是中藥梔子的主要藥效成分，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，越來越多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可能有助于防治NAFLD。我們利用pubmed及中國知網(wǎng)搜索引擎對2019年5月前發(fā)表的治療NAFLD的有效研究進(jìn)行了系統(tǒng)檢索，以探討京尼平苷的應(yīng)用及其對NAFLD治療效應(yīng)的可能作用機(jī)制。

11 京尼平苷的藥理學(xué)概述

京尼平苷(C17H24O10)是一種屬于環(huán)烯醚萜苷類的天然藥物成分，易溶于水，可被β-葡萄糖苷酶水解為京尼平和葡萄糖，在自然界中有40余種植物均可分離并鑒定出京尼平苷，而以茜草科植物占多數(shù)。京尼平苷主要來源于中藥梔子(干重果實(shí)中含3.3～8.56%)，另外地黃、杜仲、牛膝等常用中草藥也是其基本植物來源(京尼平苷含量超過1.8%)。另外，在2015年版國家藥典中，京尼平苷還被列為含梔子的約20種中成藥制劑質(zhì)量評價(jià)的定量組分，如八正合劑、龍膽瀉肝丸、清開靈軟膠囊、牛黃上清軟膠囊等[4]，而在治療肝膽疾病的經(jīng)典方劑茵陳蒿湯中京尼平苷也是主要的藥效成分[5]。京尼平苷為水溶性，一般口服給藥，口服后組織分布方面，按藥時(shí)曲線下面積AUC0→4h值計(jì)算口服后組織分別順序?yàn)槟I>脾>肝>心>肺>腦[6]。在代謝曲線實(shí)驗(yàn)中，正常雄性SD大鼠口服劑量350mg/kg的京尼平苷，鑒定出了33種代謝物，其中，血漿、尿、腎、肝中分別檢測到17、31、12、12種代謝產(chǎn)物，還有心、肺、脾、腦也分別檢測到了多種代謝產(chǎn)物，其研究結(jié)果表明京尼平苷的一個(gè)基本代謝途徑涉及C-1上羥基的水解，而另一個(gè)途徑與去甲基化、甲基化、半胱氨酸結(jié)合、糖基化和葡萄糖醛酸結(jié)合有關(guān)[7]。在臨床試驗(yàn)中，以尿中京尼平苷的濃度為指標(biāo)研究其排泄動力學(xué)，對臨床試驗(yàn)志愿者，靜脈注射腦血寧后10h內(nèi)，尿液中京尼平苷原型的累計(jì)排泄量達(dá)70%。由此可見，人體中的大多數(shù)京尼平苷是通過尿液排泄的[8]。雖然京尼平苷有多種生物活性，但肝毒性是京尼平苷安全的最基本問題，現(xiàn)有毒性研究表明SD大鼠高劑量(>500mg/kg)京尼平苷灌胃給藥24～48h后會導(dǎo)致與氧化應(yīng)激相關(guān)的肝毒性，而72.9mg/kg或更低劑量的京尼平苷即使連續(xù)口服90天也不會引起肝毒性[9]。因此，在一定劑量范圍內(nèi)，京尼平苷具有多種對人體有益的藥理作用，包括抗炎、調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、肝膽保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[10]。

2 京尼平苷治療NAFLD的潛在生物學(xué)效應(yīng)

NAFLD發(fā)病過程始于IR，進(jìn)而肝細(xì)胞脂肪變。肝細(xì)胞的脂毒性由游離脂肪酸(FFA)及其代謝產(chǎn)物引起，肝臟內(nèi)的這些變化在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上產(chǎn)生額外的代謝應(yīng)激及應(yīng)激級聯(lián)反應(yīng)，包括活性氧的釋放和免疫細(xì)胞及其他細(xì)胞損傷介質(zhì)的聚集。這些過程可導(dǎo)致進(jìn)一步的細(xì)胞損傷，誘發(fā)炎癥、細(xì)胞凋亡和纖維化[11、12]。京尼平苷治療NAFLD的相關(guān)研究目前集中在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果顯示其對NAFLD有多種有益的生物學(xué)效應(yīng)，包括改善IR、改善糖脂代謝、抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗肝纖維化等。

2.1 改善IR及糖脂代謝 IR是導(dǎo)致NAFLD發(fā)病的一個(gè)重要因素，可使細(xì)胞對葡萄糖的吸收與利用降低，葡萄糖含量升高，脂類過度分解引起循環(huán)中的FFA升高，最終脂類的聚集與分解失衡，從而導(dǎo)致脂肪在肝臟細(xì)胞中的蓄積。NAFLD及2型糖尿病患者骨骼肌中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT-4)的表達(dá)水平顯著降低，表明葡萄糖處理能力下降。有研究者運(yùn)用HepG2細(xì)胞株構(gòu)建了存在IR的細(xì)胞模型，通過觀察P62蛋白/核因子(NF)-κB/GLUT-4通路來探討京尼平苷是否能促進(jìn)該細(xì)胞自噬從而抑制IR。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GLUT-4的表達(dá)量在京尼平苷干預(yù)后8h下降到最低，京尼平苷促進(jìn)了IR狀態(tài)下HepG2細(xì)胞的自噬并顯著改善了IR，這可能與其動態(tài)調(diào)節(jié)P62/ NF-κB/GLUT-4通路有關(guān)[13]。

飲食中過多攝入糖類、脂類或者糖脂代謝失衡都會導(dǎo)致肝臟中脂肪的堆積，而多項(xiàng)研究結(jié)果表明京尼平苷對改善肝臟脂質(zhì)沉積、降低血糖、降低血脂等都有積極的治療作用，而其相關(guān)機(jī)制研究也顯示出其作用途徑多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。例如通過觀察京尼平苷干預(yù)高脂飲食誘導(dǎo)8周的NAFLD模型大鼠的藥效指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)京尼平苷組大鼠體重、脂肪重量、肝組織FFA和甘油三酯(TG)水平、血清ALT及AST活性均較模型組顯著降低，且肝組織病理也有不同程度的改善，其作用機(jī)制很可能是通過調(diào)節(jié)AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)-乙酰輔酶A 羧化酶(ACC)-丙二酰輔酶A-FFA軸來實(shí)現(xiàn)的[14]。有研究團(tuán)隊(duì)觀察京尼平苷對代謝綜合征模型(亦稱自發(fā)性肥胖2型糖尿病模型，TSOD)小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)口服京尼平苷能減輕TSOD小鼠的體重，改善脂肪代謝異常，并且經(jīng)腸道菌群代謝后的產(chǎn)物京尼平可直接作用于肝細(xì)胞，抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)積累，并顯著增加了過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，由此得出結(jié)論：改善IR及誘導(dǎo)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)是其分子機(jī)制之一[15]。

除了改善脂質(zhì)代謝，京尼平苷還具有顯著的促進(jìn)胰島素分泌、調(diào)節(jié)血糖的作用。例如，可以通過激活胰高血糖素樣肽-1受體/環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路增強(qiáng)胰島素分泌[16]；增強(qiáng)葡萄糖刺激胰島素分泌，并促進(jìn)大鼠胰島細(xì)胞株瘤細(xì)胞株INS-1的葡萄糖攝取和細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)水平，而胰島素分泌是控制代謝燃料穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，是抑制胰島β細(xì)胞功能衰竭的關(guān)鍵因素[17]；除此之外，京尼平苷(200和400 mg/kg)能顯著降低采用高脂飲食和鏈脲佐菌素注射液誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠的血糖、血清胰島素和TG水平，且其顯著抑制糖原磷酸化酶和葡萄糖-6-磷酸酶的表達(dá)[18]。在代謝性疾病研究領(lǐng)域較火熱的叉頭框蛋白1(FoxO1)可以調(diào)節(jié)機(jī)體中多種基因的表達(dá)，包括與糖脂代謝、IR、胰島β細(xì)胞增殖分化和凋亡、線粒體功能以及細(xì)胞自噬密切相關(guān)的基因，而蛋白激酶B(Akt)-FoxO1以及AMPK-FoxO1是參與胰島素誘導(dǎo)糖異生調(diào)節(jié)的典型途徑，京尼平苷可通過調(diào)節(jié)這兩條途徑來降低血糖和抑制肝糖原的異生[19、20]。另外，丙酮酸脫氫酶激酶4(PDK4)是FoxO1的主要下游直接靶基因，也是磷酸脫氫酶(PDH)激酶之一，如果骨骼肌中PDK4的表達(dá)降低，則PDH活性會增加，從而抑制脂肪酸氧化，促進(jìn)葡萄糖氧化，與對照組相比，京尼平苷降低了高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的FoxO1、PDK4、p-PDH的表達(dá)，并且經(jīng)其干預(yù)的小鼠表現(xiàn)出改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)的能力并可以降低骨骼肌的一般氧化水平，由此推斷其調(diào)節(jié)葡萄糖利用可能與通路FoxO1/PDK4/PDH相關(guān)，為代謝性疾病的治療提供了一種新的策略[21]。

2.2 抗氧化應(yīng)激損傷 在NAFLD的疾病發(fā)展過程中，脂質(zhì)過氧化及氧化應(yīng)激是單純性脂肪肝發(fā)展為脂肪性肝炎的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，肝臟作為人體代謝器官，其在正常的生理活動中能產(chǎn)生少量氧自由基，但在某些病理狀態(tài)下，游離原子團(tuán)產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致氧化產(chǎn)物的聚集。譬如，肝細(xì)胞中FFA的聚集會增加線粒體內(nèi)β氧化的反應(yīng)率，并且使細(xì)胞色素P4502E1和P4504A升高，導(dǎo)致肝臟抗氧化系統(tǒng)受抑制并且慢性消耗谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物質(zhì)，進(jìn)而造成氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化損傷。

對于氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，非酒精性脂肪肝相關(guān)模型實(shí)驗(yàn)并不多，在一項(xiàng)研究中研究者以京尼平苷(0.1g/kg/d)或京尼平苷粗提物(2g/kg/d)對大鼠灌胃4d，發(fā)現(xiàn)單體或粗體物均可升高肝臟GSH含量和胞漿GSH-S-轉(zhuǎn)移酶GST的活性[22]。另有研究表明京尼平苷在對高脂飲食誘導(dǎo)的NASH模型大鼠有顯著藥效的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)其可降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平并抑制P4502E1的表達(dá)，增加PPARα的表達(dá)，這些作用可能與超氧化物歧化酶的增加和肝臟丙二醛的降低有關(guān)，由此可見京尼平苷對高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD大鼠肝臟脂肪變性的保護(hù)作用可能與其抗氧化作用以及上調(diào)PPARα的表達(dá)相關(guān)[23]。

雖然針對NAFLD氧化應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對較少，但京尼平苷對急性酒精性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激的保護(hù)作用顯示出了其對抗氧化應(yīng)激的潛在治療效應(yīng)。在對小鼠灌胃給予京尼平苷和聯(lián)苯雙酯后2h再灌以酒精(6.0g/kg)連續(xù)7d后，研究者發(fā)現(xiàn)京尼平苷顯著逆轉(zhuǎn)了酒精性肝損傷小鼠的血清ALT/AST、GSH、GST、葡萄糖過氧化物(GPX)、銅和鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、過氧化氫酶(CAT)[24]。

2.3 改善肝細(xì)胞炎癥 氧化應(yīng)激過程會導(dǎo)致炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的釋放并造成細(xì)胞損傷。這些細(xì)胞因子主要包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和C反應(yīng)蛋白等，另外TGFβ、IL-1β、IL-8、IL-10等在肝臟炎癥發(fā)生中的相關(guān)炎癥因子，而核因子NF-κB不僅與肥胖和IR的激活密切相關(guān)，在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程中更是起到關(guān)鍵性作用，NF-κB的激活又可誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)。

京尼平苷具有強(qiáng)大的抗炎作用，在既往的藥理學(xué)研究中已經(jīng)證實(shí)京尼平苷可抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞toll樣受體4(TLR4)/NF-κB通路中的NF-κB活性，下調(diào)TNF-α、IL-1和IL-6的表達(dá)從而發(fā)揮抗炎作用[25]；能夠明顯降低CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠和脂多糖誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞-1(THP-1)細(xì)胞甲基CpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)的表達(dá)從而抑制IL-6和TNF-α的表達(dá)，京尼平苷可作為MeCP2-Hh通路的有效調(diào)節(jié)劑，具有在炎癥性疾病恢復(fù)中的潛在特征[26]；通過誘導(dǎo)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/AKT/ 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路的激活，從而保護(hù)大鼠的肝臟缺血/再灌注損傷，而其機(jī)制也是部分依賴于抑制炎癥[27]。

體外實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用油酸和棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2脂肪變性模型，有研究者發(fā)現(xiàn)京尼平苷同樣顯著抑制了NF-κB的激活，可能是一種潛在的治療NASH的藥物[28]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，京尼平苷可顯著降低db/db小鼠的空腹血清胰島素、ALT、AST、總膽固醇(TC)和TG水平及促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平[29]。另外，通過代謝組學(xué)的分析方法還證實(shí)京尼平苷的肝細(xì)胞保護(hù)作用與其抗凋亡作用密切相關(guān)[30]。

2.4 抗肝纖維化 肝纖維化是肝細(xì)胞炎癥及損傷后“傷口”持續(xù)的愈合過程，這是由于激活的肝星狀細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積所致，抑制肝纖維化的激活和增殖被認(rèn)為是治療肝纖維化的可行方法。有研究者運(yùn)用CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型，探討京尼平苷改善小鼠肝纖維化的作用機(jī)制，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)京尼平苷可顯著降低血清透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、羥脯氨酸、ALT和AST的水平。同時(shí)，京尼平苷可顯著降低α-平滑肌肌動蛋白的表達(dá)，并使I型膠原α-1沉積減少，在降低細(xì)胞存活率的同時(shí)引起激活的肝星狀細(xì)胞G2/M期細(xì)胞分裂停滯，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Shh信號通路密切相關(guān)[31]。

TGF-β1在肝纖維化發(fā)病中起著重要作用，因此有研究團(tuán)隊(duì)觀察京尼平苷對TGF-β1誘導(dǎo)的AML12細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)京尼平苷能顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Ι型膠原的mRNA和蛋白表達(dá)，并且?guī)缀跬耆钄嗔薃ML12細(xì)胞中Smad2/3、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和Akt的磷酸化。由此可見，京尼平苷可能是通過抑制TGF-β/SMAD和ERK/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路從而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化上皮間充轉(zhuǎn)化[32]。

2.5 調(diào)節(jié)膽汁酸代謝及改善膽汁淤積造成的肝損傷 膽汁酸是膽汁內(nèi)重要的組成成分之一，有約72種膽汁酸構(gòu)成了人體的膽汁酸譜。膽汁酸的生成和代謝與營養(yǎng)物質(zhì)、膽汁酸合成相關(guān)酶、膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及膽汁酸的反饋調(diào)節(jié)均有著密切的聯(lián)系，并且法尼酯受體FXR及膽汁酸受體TGR5均是NAFLD的可能治療靶點(diǎn)。

在相關(guān)的藥理學(xué)研究中，有研究表明京尼平苷可減輕α-萘異硫氰酸酯(ANIT)誘導(dǎo)的大鼠肝毒性和膽汁淤積，其機(jī)制與膽汁酸穩(wěn)態(tài)相關(guān)的酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)，京尼平苷(25、 50、100mg/kg，口服)可劑量依賴性地阻止ANIT誘導(dǎo)的肝損傷血清標(biāo)志物的變化，并降低基底外側(cè)膽汁酸的攝取和降低膽汁酸的過量生物合成，增加通過膽汁酸鹽輸出泵分泌的小管膽汁酸并在體內(nèi)下調(diào)血漿中的膽汁酸，一些重要的受體如FXR、核受體以及FXR誘導(dǎo)的小異二聚體伴侶(SHP)被激活[33]。在另一項(xiàng)研究中，給ICR小鼠以50 mg/kg京尼平苷灌胃，同樣觀察到ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積和肝損傷被改善，而相關(guān)作用機(jī)制可能與細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)3(Stat3)和NF-κB的下調(diào)有關(guān)[34]。

3 結(jié)論和展望

綜上所述 ，京尼平苷在治療NAFLD方面具有改善IR、調(diào)節(jié)糖脂代謝、對抗氧化應(yīng)激及肝損傷、抗肝細(xì)胞炎癥、抗肝纖維化，調(diào)節(jié)膽汁酸代謝并維持膽汁酸平衡等多種潛在生物學(xué)效應(yīng)。但可能由于京尼平苷的毒性報(bào)道，使得該藥物的研究和開發(fā)受到了一定的阻礙，京尼平苷的毒性呈明顯的劑量依賴性，在安全劑量范圍內(nèi)，其可發(fā)揮的有益藥理作用不容忽視。就目前研究結(jié)果來看，京尼平苷治療NAFLD的基礎(chǔ)研究仍較少，較5年之前已明顯增多，但還有許多有意義的作用機(jī)制值得探討。