崔赟謙 譚宇 吳軼群

【提要】 微球體指由天然或合成的高分子材料制成的、直徑從幾十微米到幾百微米不等的微小球體。該材料具有良好的多孔性、生物相容性、生物降解性、遞載緩釋功能以及成骨誘導(dǎo)性等優(yōu)勢，使其成為極具應(yīng)用潛能的骨組織工程材料。在骨再生過程中，微球體可為種子細(xì)胞的黏附、增殖與分化提供微環(huán)境，維系一定的立體構(gòu)型而引導(dǎo)組織細(xì)胞的遷移生長，并可作為干細(xì)胞、生長因子、藥物等的載體，更好地調(diào)控新骨形成。本文對微球體的特征及其在骨組織工程中的研究進展進行綜述，并展望該材料未來的應(yīng)用發(fā)展。

微球體指利用天然或合成的高分子材料，將固體或液體藥物包嵌成直徑幾十到幾百微米的微小球體。微球體材料來源廣泛，種類繁多，主要可分為天然高分子材料（如淀粉、殼聚糖等）、無機材料（如二氧化硅、羥基磷灰石等）和合成聚合物材料（如聚乳酸、聚乳酸/羥基乙酸等）。近年來，微球體已越來越多地應(yīng)用于骨組織工程中。

骨組織具有再生能力，正常情況下能自我修復(fù)并持續(xù)進行生理性改建。但由于炎癥、腫瘤、外傷或發(fā)育畸形等引起大面積骨缺損時則很難自愈，需借助骨移植等方法進行治療。然而，骨移植常伴隨著許多相關(guān)并發(fā)癥，如移植后供骨區(qū)易出現(xiàn)骨折、感染、疼痛，宿主免疫反應(yīng)，移植成功率低等。

微球體作為一種新型生物支架材料，具有較好的表面體積比、生物降解性、生物相容性、成骨誘導(dǎo)性以及遞載功能等優(yōu)勢，使其成為極具應(yīng)用潛能的骨組織工程材料。將其植入骨缺損區(qū)后，伴隨著骨基質(zhì)的形成和缺損區(qū)組織的重構(gòu)，微球體以與組織新生相適應(yīng)的速度逐步降解，最終被新生組織完全替換，實現(xiàn)骨再生和功能性骨的形成。在骨再生過程中，微球體可為種子細(xì)胞的黏附、增殖與分化提供微環(huán)境，維系一定的立體構(gòu)型來引導(dǎo)血管等組織細(xì)胞的遷移生長，并可作為干細(xì)胞、生長因子、藥物等的載體，更好地調(diào)控新骨形成。

本文對微球體的特征及其在骨組織工程中的應(yīng)用的研究進展進行綜述，并展望該材料未來的應(yīng)用發(fā)展的可能性。

1 微球體的特征

1.1 微球體的直徑

微球體直徑從幾十微米到幾百微米不等，其直徑受多個制備參數(shù)影響。Naito 等[1]制備的PLGA 載藥微球體直徑呈正態(tài)分布，主要集中在20～30 μm 范圍內(nèi)，平均21.07 μm。掃描電鏡觀察顯示，微球表面形態(tài)規(guī)整均勻，近似圓形。Li 等[2]用S/O/W 乳化方法制備了β-TCP 微球，當(dāng)攪拌速度為400 r/min和200 r/min 時，SEM 下可見兩種微球體直徑分別為250 μm和500 μm，表明攪拌速度可調(diào)整控制微球體大小。研究發(fā)現(xiàn)，微球體粒徑大小對藥物包封效率、產(chǎn)品注射性、藥物釋放率以及成骨效果有明顯影響。Lin 等[3]將不同尺寸的封裝了利培酮的PLGA 微球體和乙酸異丁酸蔗糖酯（SAIB）混合，研究微球體粒徑對藥物釋放率的影響。大微球體表現(xiàn)出多孔的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了藥物能更迅速地從微球體擴散到SAIB 中。因此，含有大微球的m-SAIB 在體內(nèi)初始藥物釋放速度較快，隨后逐漸減慢。小微球內(nèi)部孔隙較少，初始藥物釋放量顯著降低，4～54 d 的藥物釋放率略有升高。Liao 等[4]研究了PLGA微球尺寸對注射CPC/PLGA 后豚鼠脛骨模型骨形成的影響。將注射磷酸鈣水泥（CPC）和PLGA 微球體兩種制劑一起注射到經(jīng)骨髓切除的脛骨髓腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)成骨效果與PLGA 微球尺寸有關(guān)。含有小直徑PLGA 微球的CPC 的骨形成總量是含有大直徑PLGA 微球的CPC 的兩倍。

1.2 微球體的孔隙形貌

不同于傳統(tǒng)微球體的實心特征，多孔微球在表面有外部孔隙，或在核內(nèi)有內(nèi)部孔隙（外部和內(nèi)部通常是互連的），活性物質(zhì)可以溶解或分散在微球表面或核內(nèi)。多孔結(jié)構(gòu)使微球體具有如下優(yōu)勢：多孔結(jié)構(gòu)具有大的比表面積和孔體積，藥物可吸附在多孔微球的表面或進入孔道內(nèi)部，通過孔結(jié)構(gòu)的調(diào)整可實現(xiàn)藥物釋放速度的可控性；多孔結(jié)構(gòu)致使微球密度低；孔隙率在產(chǎn)能效率和釋放動力學(xué)方面起著重要作用。眾多研究證實，孔隙的直徑、數(shù)量和結(jié)構(gòu)是影響多孔微球性能的關(guān)鍵因素。Yuan 等[5]以明膠微球制備組織工程支架，發(fā)現(xiàn)支架的孔徑大小與明膠微球的大小直接相關(guān)，呈現(xiàn)出相同的大小變化趨勢，且支架的孔徑大小對不同細(xì)胞的黏附作用不同。Hossain 等[6]發(fā)現(xiàn)通過簡單地選擇玻璃配方和顆粒大小，可以很容易地控制微球孔隙度（與其表面積有關(guān)）?？紫堵实脑黾訉?dǎo)致降解過程中質(zhì)量損失的增加，并因表面積變大，使得離子釋放量增多，從而控制用于潛在生物治療離子的離子釋放速率。

1.3 生物相容性

微球體與機體的生物相容性與其本身的物理性狀（如體積、形狀、介孔大小等）及表面化學(xué)性質(zhì)（表面電荷、親水性、表面基團種類等）密切相關(guān)。目前認(rèn)為，各種類型的微球體只要以最優(yōu)化的結(jié)構(gòu)和合適的劑量使用于機體，則可以認(rèn)為是無害的，并且可以通過表面改性賦予其更多的性能，以進一步改善材料的生物相容性，降低對機體的毒性。Chen 等[7]采用S/O/W 技術(shù)將負(fù)載牛血清白蛋白（BSA）的卵磷脂納米顆粒，通過卵磷脂囊泡的初始自組裝和隨后的脂質(zhì)轉(zhuǎn)化獲得，然后封裝到PLGA 基質(zhì)中形成復(fù)合微球。PLGA 復(fù)合微球比傳統(tǒng)的水包油（W/O/W）雙乳液法制備的聚乳酸（PLGA）微球具有更好的生物相容性，且無明顯的細(xì)胞毒性。Hsu 等[8]在PMMA微球表面制備了一層薄的磷灰石，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力比對照組有所增強，說明磷灰石層提高了微球?qū)Τ晒羌?xì)胞的相容性。

1.4 緩釋作用

因微球體性質(zhì)穩(wěn)定，生物相容性好，故可作為載體負(fù)載各種藥物，以實現(xiàn)藥物輸送功能，緩慢釋放藥物，釋藥結(jié)束后載體在體內(nèi)經(jīng)生物降解自行消除，這對生物活性易丟失的多肽及蛋白類藥物具有很好的實用價值。1974 年，Kramer 等[9]制備了白蛋白微球體，負(fù)載巰基嘌呤后可在體外有效釋放。微球體作為良好的緩釋系統(tǒng)可避免藥物在體內(nèi)被組織液迅速稀釋和代謝，或因酶的作用而失活，使藥物集中在靶組織附近定位釋放，提高治療效果。Zhang 等[10]將一線抗HBV 藥物恩替卡韋（ETV）包封進PLGA 微球，研發(fā)出持續(xù)緩釋的治療乙肝的藥物輸送系統(tǒng)，從而避免乙肝患者因間斷使用抗HBV 藥物而病情加重，減少病毒反彈的機會和給藥的頻率，也可減輕每天空腹服用ETV 而導(dǎo)致的惡心、嘔吐、腹痛等不良反應(yīng)，提高患者的依從性，改善治療效果。此外，通過緩釋系統(tǒng)還可延長藥物在體內(nèi)的作用時間，更好地促進細(xì)胞增殖、分化和組織再生。Qutachi 等[11]制備了一種可降解的PLGA微球，可在7 d 內(nèi)以局部有效濃度持續(xù)釋放VEGF，實現(xiàn)生理血管生成，避免因VEGF 的過度釋放而造成血管滲漏，適用于缺血性組織或傷口的治療。

為避免患者產(chǎn)生不良反應(yīng)，作為載體的微球應(yīng)有效控制藥物突釋效應(yīng)，使藥物平穩(wěn)、緩慢釋放。微球體內(nèi)部的藥物釋放取決于微球體結(jié)構(gòu)的侵蝕和破壞作用，故可通過改變微球體材料的表面離子特性或材料聚合物的結(jié)構(gòu)來改變藥物緩釋曲線。Khan 等[12]采用交聯(lián)法制備白蛋白微球，將微球的表面性質(zhì)由親水性變?yōu)槭杷?，從而改變藥物的釋放。交?lián)度越高，白蛋白的溶解度越低，藥物從微球中的釋放越慢。Lei等[13]通過制備包裹生長因子的PLLA-PLGA 雙層核殼式微球來研究微球體中影響蛋白釋放的參數(shù)。研究結(jié)果表明，外殼中的蛋白質(zhì)首先釋放，再是核中的蛋白質(zhì)被釋放。此外，通過改變封裝材料的比例，可以調(diào)整核心和外殼中生長因子的釋放速率。

1.5 生物降解性

伴隨著骨基質(zhì)的形成和缺損區(qū)組織的重構(gòu)，微球體以與組織新生相適應(yīng)的速度逐步降解，最終新生組織完全置換支架材料，實現(xiàn)骨再生和功能性骨的形成。Wei 等[14]在裸鼠背部皮下注射載hBMSC 的PLGA/5SL/BMP-2 和PLGA/BMP-2 微球，進行體內(nèi)異位骨形成試驗。HE 染色、Masson 三色染色和OCN 染色顯示，第1 周未觀察到PLGA 基微球的明顯形態(tài)變化；第8 周，部分PLGA 基微球出現(xiàn)畸形，部分間隙出現(xiàn)在PLGA 基微球中。提示PLGA 微球在體內(nèi)異位骨形成過程中緩慢降解。Wei 等[15]制備了聚羥基脂肪酸酯中空多孔微球（PHA OPMs），皮下注射入小鼠體內(nèi)，6 個月后，HE 染色發(fā)現(xiàn)PHA OPMs 降解成不規(guī)則形狀，PHA 降解主要釋放3-羥基丁酸，可促進周圍組織的生長。研究顯示，可通過調(diào)整蛋白酶的濃度控制微球的降解速度。Annamalai 等[16]制備了明膠微球，使用不同濃度的膠原酶在37 ℃下降解微球，發(fā)現(xiàn)微球的降解呈現(xiàn)劑量依賴性。在低膠原酶濃度（1.0 g/mL）下，微球的降解可忽略不計（觀察時間超過48 h）。在高膠原濃度（7.5 mg/mL和10 mg/mL）下，微球降解速度非?？?，隨后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)膠原酶濃度為5.0 mg/mL 時，微球降解穩(wěn)定且持續(xù)時間超過48 h。

1.6 抗感染特征

植骨區(qū)感染是造成植骨失敗的重要原因。研究顯示可通過在微球體中添加各類抗炎癥成分來增強微球體的抗感染性能。小檗堿（Bbr）是一種水溶性異喹啉生物堿，具有抗真菌、抗炎、抗菌等生物藥理作用。Cai 等[17]將CMCSM、Bbr/CMCSM 微球體分別和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)24 h，通過觀察材料周圍藥物擴散而抑制細(xì)菌引起的圓環(huán)來進行評價。CMCSM 組未觀察到明顯的抑菌環(huán)；而Bbr/CMCSM 組培養(yǎng)皿中央出現(xiàn)抑制區(qū)，表明Bbr 有顯著的抗菌活性。Wei 等[18]制備了表面負(fù)載納米銀和磷灰石的微球，研究其抗菌性能。將微球和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)24 h 后，出現(xiàn)了明顯的抑制區(qū)，展現(xiàn)了良好的抗菌作用，其抗菌活性主要來自微球中銀離子的持續(xù)釋放。后進行體內(nèi)試驗，制備SD 大鼠感染顱骨缺損模型（φ=8 mm）。植入微球體術(shù)后1 個月，與對照組相比，表面負(fù)載納米銀和磷灰石的微球組感染明顯減輕，HE 染色顯示成骨效果更好，證實了表面負(fù)載納米銀和磷灰石的微球確實能有效治療有感染風(fēng)險的骨缺損。Qiao 等[19]將PLGA 微球體包封莫西沙星，在體外能緩慢釋放莫西沙星。實驗證明MOXPLGA 微球具有較強的抗菌活性和抗菌生物膜抑制性能，因此新型MOX-PLGA 微球可作為治療骨髓炎的良好載體。

2 微球體在骨組織工程中的研究及應(yīng)用

微球支架在骨組織工程中的應(yīng)用已引起了廣泛的關(guān)注。微球體在理化性能上很好地模擬了天然的骨細(xì)胞外基質(zhì)，能促進成骨過程[20]。Borden 等[21]將可生物降解PLGA 微球制備成微球支架，所制備的支架具有30%～40%的孔隙率，孔隙互連度為100%，可作為松質(zhì)骨再生的模板；抗壓強度范圍在130～300 MPa 之間，適用于骨再生。此外，細(xì)胞實驗表明，骨髓干細(xì)胞可在相鄰微球體孔隙周圍的同心圓間形成有張力的細(xì)胞質(zhì)連接[22]。由于天然的球形結(jié)構(gòu)，微球支架修復(fù)再生組織的方式與由排列在中央哈弗氏管周圍、同心圓樣的礦化膠原片所組成的骨小梁十分相似[20]。

在現(xiàn)有的方法中，生物活性玻璃與可降解聚合物的組合方式備受關(guān)注[23]。該方法能充分發(fā)揮生物玻璃的骨再生性能和可降解聚合物的球化能力?；钚噪x子如鈣、磷酸鹽和硅可以從玻璃成分中釋放出來，并影響細(xì)胞功能，如細(xì)胞增殖、分化和礦化[24]。因此，離子控制成骨功能被認(rèn)為是使用生物活性玻璃與聚合物復(fù)合微球的一個重要優(yōu)點。研究證明，磷酸鈣和磷酸三鈣（TCP）可以加入微球支架中，加入的陶瓷增強了與骨組織相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分的分泌，刺激細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[25-26]。Bo Li 等[2]制備了可注射的β-TCP 微球，在兩周的測試期間微球持續(xù)釋放Ca2+，顯示良好的生物降解性并提供鈣來源。β-TCP 微球有效提高了BMSC 骨基因（OCN、RUNX2）的表達(dá)，證實微球可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化。將聯(lián)合培養(yǎng)的BMSC 和微球成功植入8 周齡裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)β-TCP微球可形成一個誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化和骨再生的微環(huán)境，這意味著β-TCP 微球作為骨替代材料有著潛在的應(yīng)用前景，可修復(fù)形狀不規(guī)則的骨缺損。

微球體不僅可以支撐缺損空間作為組織工程骨再生的框架，也能通過遞載各類分子離子、生長因子及藥物更好地調(diào)控新骨形成。

在微球體中摻雜鋅、鍶等元素，有利于促進成骨并修復(fù)骨缺損。研究表明，鍶通過降低破骨細(xì)胞活性、增加破骨細(xì)胞凋亡，同時增強成骨細(xì)胞活性、減少成骨細(xì)胞凋亡來減少骨吸收[27-29]。Henriques 等[30]在Hap 微球中摻雜鍶，實驗發(fā)現(xiàn)在骨缺損模型中，含鍶微球組比不含鍶微球組更早地形成新骨，生成新骨的體積更多且外形愈合更良好。

通過微球體負(fù)載生長因子促進組織工程骨再生也是近年來研究的熱點之一。BMP-2 是轉(zhuǎn)化生長因子超家族（TGFβ）的成員，對骨形成有刺激作用。然而，盡管BMP-2 具有很強的骨誘導(dǎo)活性，但由于缺乏合適的遞送系統(tǒng)，其臨床應(yīng)用受到限制[31]。Lee 等[32]制備了負(fù)載BMP-2 的PLGA 微球體，并將其制作成3D 支架，研究成骨效果。將負(fù)載BMP-2 的支架和未負(fù)載BMP-2 的支架分別與MC3T3-E1 共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)負(fù)載BMP-2 支架組中骨組織相關(guān)基因ALP、OCN 以及COL-1的表達(dá)均更高。同時，體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，負(fù)載BMP-2 支架相比對照組可提供更好的骨再生環(huán)境，大鼠顱骨骨缺損區(qū)域減小，骨形成區(qū)迅速增加。Zhang 等[33]將BMP-2 模擬肽P24 負(fù)載至PLLA 基微球，并與兔BMSC 混合，皮下注射至裸鼠體內(nèi)。同空白對照的PLLA 基微球相比，偶聯(lián)P24 的PLLA 基微球具有生物學(xué)功能，在誘導(dǎo)兔BMSC 成骨分化及異位骨形成方面有良好的成骨特性。

糖皮質(zhì)激素對于誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化和形成礦化細(xì)胞外基質(zhì)有著重要的影響。Dawes 等[34]制備了載地塞米松PLGA微球，分別以不同濃度與SV-HFO 細(xì)胞共培養(yǎng)，經(jīng)過7 d 的孵育，ALP 活性表達(dá)強烈，茜素紅染色發(fā)現(xiàn)基質(zhì)礦化隨微球濃度的增加而增加，證實了負(fù)載地塞米松的PLGA 微球通過地塞米松的持續(xù)釋放誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。辛伐他汀具有成骨和成血管活性，Yu 等[35]研究了負(fù)載辛伐他汀的介孔羥基磷灰石（S-MHMs）對大鼠BMSC 成骨分化及新生血管生成的影響。結(jié)果表明，S-MHMs 能同時促進骨再生和新生血管形成，在骨缺損修復(fù)方面具有巨大的潛力。Li 等[36]的研究表明，負(fù)載姜黃素PLGA 微球可以通過減輕線粒體功能障礙，調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/HO-1 信號通路，抑制糖尿病誘導(dǎo)的活性氧生成。因此，糖尿病對BMSC 增殖、遷移和成骨分化的負(fù)面影響也明顯減輕。將負(fù)載姜黃素PLGA 微球植入2 型糖尿病大鼠骨缺損，與單純支架植入相比，前者顯示出更強的成骨能力。

骨再生治療方法的成功與否取決于支架內(nèi)血管的浸潤程度[37]。為進一步驗證微球體在骨再生方面的潛力，Jabbarzadeh等[38-39]證實內(nèi)皮細(xì)胞在微球支架上表現(xiàn)出正常的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能表型，說明微球體植入體內(nèi)時能支持血管的形成，促進周圍組織的血管浸潤。Boldbaatar 等[40]制備了摻鈷的硅酸鹽微球，可持續(xù)釋放雙離子（硅酸鹽和鈷），被證明可協(xié)同上調(diào)血管生成的關(guān)鍵基因，如HIF1 -α、VEGF 及KDR 等。離子的摻入促進了內(nèi)皮細(xì)胞的極化、遷移、歸巢和新生血管的生成。

3 小結(jié)

微球體具有良好的多孔性、生物相容性、機械學(xué)性能、緩釋功能、生物可降解性，作為骨組織工程中的新型支架材料，為修復(fù)骨缺損提供了新思路。與傳統(tǒng)組織工程支架相比，微球支架有許多優(yōu)勢：①多孔網(wǎng)絡(luò)；②緩釋生物活性因子和藥物；③可注射性及可塑性使其在微創(chuàng)手術(shù)中有應(yīng)用潛力。但尚存一些不足，有待進一步研究解決：微球的制備過程影響因素較多，微球粒徑大小、微孔的形態(tài)與孔徑大小等不能精確控制；微球的載藥率和包封率相對較低；制備過程中采用的致孔劑、有機溶劑等未能從產(chǎn)品中徹底除去等。隨著研究的不斷深入，新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，微球體在骨組織工程中的應(yīng)用將越來越廣泛。