張佩佩 劉俊*

感音神經(jīng)性耳聾（SNHL）是臨床常見疾病，是內(nèi)耳毛細(xì)胞（HCs）和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（SGN）損傷、缺失或壞死所致。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球至少2.78億人患有中度至重度聽力損失，約2/3生活在發(fā)展中國家［1］，其中感音神經(jīng)性聽力下降占大部分。在哺乳動(dòng)物中，HCs的損傷是永久性的，因耳蝸中無自發(fā)的HCs增殖或細(xì)胞替代［2］。目前SNHL治療主要以藥物治療、佩戴助聽器和電子耳蝸植入為主，其中藥物治療只有部分有效，助聽器和電子耳蝸只是起到替代作用，不能提供生物耳朵的敏銳度。近年來，干細(xì)胞移植成為治療感音神經(jīng)性耳聾的研究熱點(diǎn)。隨著對(duì)干細(xì)胞研究的不斷深入，在一些動(dòng)物模型上已取得可靠依據(jù)［3］，但在移植路徑上，如何在對(duì)內(nèi)耳結(jié)構(gòu)損傷最小的情況下，將干細(xì)胞安全、有效移植到損傷部位或最接近損傷部位，仍需我們進(jìn)一步探索。

1 干細(xì)胞移植特征

干細(xì)胞主要特點(diǎn)是自我更新和多潛能分化傾向。實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)耳干細(xì)胞不僅可分化成毛細(xì)胞，還有多分化潛能，在進(jìn)行內(nèi)耳干細(xì)胞移植研究中發(fā)現(xiàn)，移植的多種干細(xì)胞可以在內(nèi)耳中存活、分化，能夠表達(dá)毛細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物。目前研究干細(xì)胞有內(nèi)耳干細(xì)胞和外耳干細(xì)胞。外耳干細(xì)胞包括神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等多功能干細(xì)胞。

1980年以來，發(fā)現(xiàn)禽類聽覺上皮細(xì)胞在耳毒性損傷后HC明顯再生［4］，具有里程碑意義。對(duì)禽類和其非哺乳的研究發(fā)現(xiàn)，由支持細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為HC［5］和支持細(xì)胞分化為HC和支持細(xì)胞，這兩種機(jī)制實(shí)現(xiàn)內(nèi)耳HC再生。Li等［6］首先在體外研究了小鼠內(nèi)耳中不同部位的細(xì)胞具有再生潛能，發(fā)現(xiàn)出生后4個(gè)月內(nèi)小鼠前庭感覺上皮具有再生能力。但生后2～3周內(nèi)，聽覺感覺上皮則不具有再生能力。自發(fā)現(xiàn)小鼠耳蝸毛細(xì)胞可再生以來，較多研究人員陸續(xù)開展了相關(guān)研究，以進(jìn)一步明確耳蝸中那些部位細(xì)胞具有再生能力。為此，與再生能力及多能性相關(guān)的蛋白分子及其他分支標(biāo)志物受到越來越多的重視，如p27Kip1、Nestin和Lgr等。ip27Kip1是由p27Kip1基因編碼的p27Kipl蛋白，為細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（CDKI），可抑制細(xì)胞增殖。在胚胎期至成年期的小鼠耳蝸中均發(fā)現(xiàn)p27Kip1的存在［7］。證據(jù)表明，圍生期耳蝸中SCs在體外時(shí)p27Kip1的表達(dá)下降，從而內(nèi)耳細(xì)胞可以繼續(xù)增殖，分化。但出生14d后，僅有小部分的耳蝸SCs可轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞樣細(xì)胞［8］。相關(guān)研究表明哺乳動(dòng)物耳蝸含有干細(xì)胞樣細(xì)胞，其在某些情況下能夠補(bǔ)充HC和支持細(xì)胞，但一般在出生后1周左右就消失且數(shù)量較少，不能滿足毛細(xì)胞再生的需求。如能激發(fā)內(nèi)耳自身干細(xì)胞分裂、分化并再生為內(nèi)耳毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，將為感音神經(jīng)性耳聾治療帶來新的希望。

由于內(nèi)耳干細(xì)胞的再生和分化數(shù)量有限，外耳干細(xì)胞因增殖和分化的巨大潛力，為替換和修復(fù)受損或壞死的毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)開辟了新思路。如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）的發(fā)現(xiàn)為干細(xì)胞的相關(guān)研究開創(chuàng)新路徑，其在耳聾治療方面的潛力受到廣泛關(guān)注。實(shí)驗(yàn)研究證明，人類iPSCs的產(chǎn)生只需要Oct4基因的誘導(dǎo)［9］。經(jīng)過相關(guān)處理，移植到耳蝸中iPSC 1周觀察到其存活、分化并表達(dá)神經(jīng)元的標(biāo)記物，表明其在宿主組織中存在分化潛力［10］。神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）也在內(nèi)耳移植實(shí)驗(yàn)中取得證據(jù)。Parker等［11］用胎兒期小鼠小腦細(xì)胞NSC植入耳蝸后發(fā)現(xiàn)神經(jīng)組織（衛(wèi)星，螺旋神經(jīng)節(jié)和施萬細(xì)胞）和Corti器官細(xì)胞（HCs和SCs）樣的特征細(xì)胞。但相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需進(jìn)一步證實(shí)。

2 移植徑路

不同的干細(xì)胞移植方法，不僅對(duì)干細(xì)胞在內(nèi)耳遷移、以成活及分化產(chǎn)生較大差異，且能影響干細(xì)胞的效能及實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，為了發(fā)揮干細(xì)胞的最佳效能，選擇合適的移植方法是關(guān)鍵。而移植方法的選擇，需依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的具體情況而定；并需熟悉掌握與耳相關(guān)解剖知識(shí)、嫻熟的外科操作技術(shù)。因此相關(guān)的研究者嘗試不同的移植方法并比較不同移植方法之間的效果。目前內(nèi)耳干細(xì)胞移植的徑路主要有外淋巴路徑和內(nèi)淋巴路徑。

2.1 外淋巴途徑 （1）耳蝸底回路徑。外淋巴移植方法中內(nèi)耳干細(xì)胞經(jīng)耳蝸內(nèi)移植方法應(yīng)用最廣泛，該方法是在雙目手術(shù)顯微鏡下暴露聽泡及蝸窗，在耳蝸底回鼓階外側(cè)壁開一小孔，此時(shí)可見清亮的外淋巴液。經(jīng)鼓階注入內(nèi)耳干細(xì)胞，注射完畢后取少許乳突部肌肉磨碎后封閉耳蝸底回造孔處，逐層縫合皮膚切口［12］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，該移植徑路可借助外淋巴液的流動(dòng)帶動(dòng)細(xì)胞在耳蝸中的分布，對(duì)耳蝸結(jié)構(gòu)的損傷較小等優(yōu)點(diǎn)。陳觀貴［12］用該方法將經(jīng)DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole）熒光標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）移植至內(nèi)耳后，觀察其存活及分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不僅在耳蝸的鼓階及前庭階中均有BMMSCs的分布且細(xì)胞呈現(xiàn)多形性。并在耳蝸的外側(cè)壁及基膜上均可見到熒光信號(hào)細(xì)胞。表明移植干細(xì)胞有較強(qiáng)的活力及遷移力，并未見細(xì)胞大量堆積于管腔的情況，說明對(duì)前庭功能影響較小。李利等［13］經(jīng)鼓階打孔法將綠色熒光蛋白（EGFP）未經(jīng)體外誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞（ESCs）移植鼓階中，36h后發(fā)現(xiàn)鼓階、鼓階外側(cè)壁和基地膜嵴處皆有ESCs的存活增殖，表現(xiàn)為成簇或貼壁生長。表明在外淋巴環(huán)境中，ESCs不再是未分化狀態(tài)的細(xì)胞團(tuán)，但也沒有類胚體細(xì)胞的分化。（2）蝸窗膜路徑。在手術(shù)顯微鏡下用鋼針或其他工具打開聽泡，暴露蝸窗龕。用微量注射器通過蝸窗膜將目的細(xì)胞注入大鼠鼓階。該方法優(yōu)點(diǎn)是與其他部位比較，操作簡(jiǎn)單，對(duì)耳蝸損傷較小，能保持耳蝸的自然解剖結(jié)構(gòu)；細(xì)胞在外淋巴液中能夠隨著淋巴液的流動(dòng)而擴(kuò)散，到達(dá)相應(yīng)的結(jié)構(gòu)。雷靂［14］將3種病毒載體通過蝸窗膜注入鼓階的外淋巴液中，觀察其在耳蝸表達(dá)分布情況。實(shí)驗(yàn)觀察到從耳蝸底轉(zhuǎn)到頂轉(zhuǎn)均有基因轉(zhuǎn)染，熒光強(qiáng)度梯度減弱，證明3種病毒在耳蝸中已成功表達(dá)，為基因治療提供了依據(jù)。Chen等［15］通過圓窗至耳蝸的方法將已準(zhǔn)備好的內(nèi)耳上皮主細(xì)胞（ONPs）移植到已建好聽神經(jīng)損傷的模型中，不僅觀察到移植細(xì)胞的遷移、分化，還能檢測(cè)到其對(duì)聽力的修復(fù)作用。Jeon等［16］用該方法將BMMSCs移植入小鼠耳蝸中，發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞整合到感覺上皮細(xì)胞中并最終分化為成熟的HC樣細(xì)胞。Lang等［17］發(fā)現(xiàn)在螺旋神經(jīng)節(jié)損傷后（1～3d）通過圓窗注射的小鼠胚胎干細(xì)胞可在Rosenthal小管及鼓階中存活較長時(shí)間，但在中階中存活時(shí)間較短。Chen等［18］通過圓窗將誘導(dǎo)的多功能干細(xì)胞（iPSs）注射小鼠的耳蝸中，發(fā)現(xiàn)iPSCs在耳蝸中遷移至Corti器，并分化成毛細(xì)胞標(biāo)記物毛細(xì)胞樣細(xì)胞，該毛細(xì)胞樣細(xì)胞還可與體內(nèi)原有的SGN形成突觸連接，表明iPSCs內(nèi)耳的移植對(duì)于毛細(xì)胞的再生是可行的，為耳聾的治療帶來希望。付勇等［19］經(jīng)該路徑將攜帶綠色熒光蛋白的重組腺病毒（Ad-GFP）的大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞移植至大鼠耳蝸中，發(fā)現(xiàn)移植后大鼠聽反應(yīng)閾ABR結(jié)果未見明顯差異，通過掃描電鏡觀察到耳蝸外毛細(xì)胞有極少散在缺失（總?cè)笔剩?%），與對(duì)照組比較后發(fā)現(xiàn)該路徑對(duì)大鼠的聽反應(yīng)閾及耳蝸的結(jié)構(gòu)未見明顯影響。

有研究者將大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)蝸窗移植到正常大鼠耳蝸，2周后分別測(cè)試大鼠的聽性腦干反應(yīng)及觀察耳蝸形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞對(duì)大鼠聽覺反應(yīng)閾及耳蝸形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯影響，耳蝸各回均有移植細(xì)胞，大部分移植細(xì)胞以簇狀存在于外淋巴液中，其中部分位于鼓階及前庭階壁、部分貼附于前庭膜、部分附于鼓階側(cè)基底膜，另外有一部分神經(jīng)干細(xì)胞位于螺旋神經(jīng)節(jié)，極少一部分存在于內(nèi)淋巴系統(tǒng)，附于蓋膜上，螺旋韌帶和基底膜均未發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞［20］。（3）外半規(guī)管路徑。Iguchi等［21］將小鼠神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)外半規(guī)管（LSCC）路徑移植到耳蝸中，2周后在所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳蝸（主要是前庭階和鼓階）底回至頂回均可見到源自胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)球，膜蝸管中也發(fā)現(xiàn)少量的細(xì)胞（約0.4%），但本實(shí)驗(yàn)并無直接證據(jù)證明細(xì)胞可以達(dá)到蝸軸。而這種移植方法使高頻（40 kHz）ABR 閾值輕度升高（10～15dB SPL）。Kamiya［22］將間充質(zhì)干細(xì)胞通過后半規(guī)管路徑注入模型大鼠（由線粒體毒素誘導(dǎo)的纖維細(xì)胞功能障礙引起的急性感覺神經(jīng)性聽力損失的新型大鼠模型）耳蝸中，在壺腹嵴和鼓階可以觀察到遷移、增殖的干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證明間充質(zhì)干細(xì)胞移植提高模型大鼠部分聽力，表明移植的間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)際上侵入損傷區(qū)域，并促成受損耳蝸的結(jié)構(gòu)重組。

經(jīng)外淋巴途徑方法移植內(nèi)耳干細(xì)胞雖然操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但也有其缺點(diǎn)：定向遷移能力差，干細(xì)胞經(jīng)蝸窗膜注入外淋巴液中只能夠隨著外淋巴液的流動(dòng)而擴(kuò)散，無法精確定向或定位遷移；其他潛在并發(fā)癥，如細(xì)胞可通過耳蝸導(dǎo)水管擴(kuò)散至腦脊液中［23］。

2.2 內(nèi)淋巴途徑 直接經(jīng)內(nèi)淋巴的方法移植目的干細(xì)胞報(bào)道較少，因這種方法存在巨大的技術(shù)障礙，還要克服耳蝸本身生物學(xué)障礙：內(nèi)淋巴液是一種特殊的細(xì)胞外溶液，其特征是高鉀（K+，153.8mol/L）［24］，可降低移植細(xì)胞存活的可能性，這對(duì)成功應(yīng)用內(nèi)淋巴移植途徑構(gòu)成了巨大障礙［25］。螺旋器毛細(xì)胞和支持細(xì)胞之間的粘附連接和緊密連接使細(xì)胞遷移非常困難。因此，經(jīng)內(nèi)淋巴液移植目的干細(xì)胞比外淋巴途徑難度大。（1）蝸管路徑。Hildebrand等［26］通過圓窗插入一個(gè)經(jīng)過基底膜的細(xì)管將胚胎外胚層組織移植到致聾的豚鼠耳蝸中。9周后總的存活率約19.1%（存在于蝸管、鼓階和前庭階），其中14%位于蝸管，有一些靠近螺旋器，但無細(xì)胞分化及整合入宿主組織的證據(jù)。表明在高鉀環(huán)境中，部分細(xì)胞存活，但存活細(xì)胞能否在螺旋器中分化并替換螺旋器中損傷的毛細(xì)胞仍缺乏確鑿的證據(jù)。（2）耳蝸外側(cè)壁路徑。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)移植細(xì)胞通過耳蝸外側(cè)壁［27］移植到內(nèi)耳中，移植的成功率較高。且這種手術(shù)對(duì)耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)無明顯影響，耳蝸基底膜鋪片發(fā)現(xiàn)毛細(xì)胞基本沒有缺失［28］。Zhang等［29］利用該方法將神經(jīng)干細(xì)胞移植入SD大鼠耳蝸，1周后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞主要分布于耳蝸外側(cè)壁、基底膜、骨螺旋板和Rosenthal'S管，極少數(shù)位于前庭階、鼓階、蝸管和螺旋器附近；遷移至Rosenthal'S管的細(xì)胞能夠分化為神經(jīng)元，且對(duì)正常耳蝸功能影響有限。張鵬志［28］通過外側(cè)壁徑路將嗅球神經(jīng)干細(xì)胞移植入SGNs損傷的大鼠耳蝸中，1周后發(fā)現(xiàn)耳蝸中各部分均有存活的干細(xì)胞，并且遷移至螺旋神經(jīng)節(jié)處的干細(xì)胞大部分不再表達(dá)干細(xì)胞的標(biāo)志物巢蛋白，而大部分分化為神經(jīng)元細(xì)胞，表達(dá)Tubulin。同時(shí)發(fā)現(xiàn)毛細(xì)胞無明顯缺失，表明該徑路對(duì)大鼠耳蝸結(jié)構(gòu)功能影響有限。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該徑路移植后細(xì)胞存活數(shù)為（29.5±9.5）［30］，低于 Okano 等報(bào)道蝸軸移植后細(xì)胞存活數(shù)（312±245）［31］。而與經(jīng)鼓階徑路移植，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞主要在前庭階、鼓階處分布不同。

在干細(xì)胞內(nèi)耳移植研究中，相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基于干細(xì)胞的分化、再生治療SNHL是有效果的。但選擇所移植干細(xì)胞種類及最優(yōu)的干細(xì)胞內(nèi)耳移植路徑時(shí)，需要考慮多方面的因素，包括干細(xì)胞移植時(shí)的分化階段、內(nèi)耳受損后最佳的移植時(shí)間、移植路徑對(duì)內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的損傷，對(duì)殘留聽力的影響等。選擇最佳的移植路徑，對(duì)移植后干細(xì)胞存活、分化、再生尤為重要。

3 展望

目前干細(xì)胞內(nèi)耳移植在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方面已取得一定的進(jìn)展，但也面臨重大挑戰(zhàn)。干細(xì)胞內(nèi)耳移植的相關(guān)研究均是基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)等，未行臨床人體實(shí)驗(yàn)的研究，在后續(xù)的臨床實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用中，相關(guān)研究的結(jié)論仍需臨床上進(jìn)一步研究論證。干細(xì)胞內(nèi)耳移植的各種路徑選擇未行成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同移植路徑需大量實(shí)驗(yàn)研究其安全及有效性，及其對(duì)干細(xì)胞在目標(biāo)部位的成活、分化等問題制約著干細(xì)胞內(nèi)耳移植的臨床研究與應(yīng)用。因此如何選擇最佳的移植徑路，建立高效、安全、低損傷的耳蝸干細(xì)胞移植方法，同時(shí)降低內(nèi)耳其他因素的影響，仍有待于進(jìn)一步的探索，干細(xì)胞的移植治療SNHL在臨床應(yīng)用上仍需進(jìn)一步研究論證。但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì)干細(xì)胞內(nèi)耳移植路徑研究不斷深入，利用干細(xì)胞移植將是未來治療感音神經(jīng)性耳聾的新型、有效的方法。