孫照英， 聶彥彥， 趙華南， 劉志明*

(1. 東北林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040； 2. 青島海慈醫(yī)療集團(tuán)， 山東 青島 266100； 3. 哈藥集團(tuán)技術(shù)中心， 黑龍江 哈爾濱 150020)

1-脫氧野尻霉素(DNJ)為桑葉的提取物，是一種強(qiáng)力降血糖物質(zhì)，可用于治療糖尿病[1]。1-脫氧野尻霉素進(jìn)入體內(nèi)后存在釋放不平穩(wěn)的特點(diǎn)，導(dǎo)致血糖過度降低而出現(xiàn)不良反應(yīng)，因此患者依從性差[2-3]。而普通制劑存在給藥頻繁、血藥濃度波動(dòng)大、不方便患者長期服用等缺點(diǎn)，只有研發(fā)出能持續(xù)平穩(wěn)的降血糖藥物才能適應(yīng)目前的臨床需要。滲透泵控釋制劑是以零級(jí)恒速釋藥為基本特征，以膜內(nèi)外的滲透壓差為釋藥動(dòng)力的一種新型制劑。滲透泵片釋藥行為不受環(huán)境pH值、胃腸蠕動(dòng)等因素影響，可最大限度地避免或減少血藥濃度波動(dòng)，提高藥物制劑的安全性和有效性，可減少服藥次數(shù)，提高患者的依從性，可避免普通制劑存在的不足，并且開發(fā)周期短，經(jīng)濟(jì)效益好[4-9]。本研究將DNJ制備成雙層滲透泵片制劑，優(yōu)化處方后進(jìn)行了比格犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究，以期為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1原料、試劑與儀器

1-脫氧野尻霉素(DNJ)原料藥、DNJ速釋片(40 mg)，哈藥集團(tuán)制藥總廠；DNJ對(duì)照品(純度99.2%)，中檢所；聚氧乙烯(PEO)，上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司；羥丙基甲基纖維素(HPMC)E50、聚乙二醇(PEG)4000、氯化鈉和滑石粉，均購于安徽山河輔料有限公司。醋酸纖維素(CA)、乙醇、甲醇、乙腈、醋酸銨、乙醚、二氯甲烷，均為市售分析純?cè)噭?/p>

TDP型單沖壓片機(jī)，上海第一制藥機(jī)械廠；WBF5包衣鍋，重慶英格造粒包衣技術(shù)有限公司；1260高效液相色譜儀和VK7030全自動(dòng)溶出儀，美國Agilent公司。

健康比格犬6只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄各半，體重(12±2)kg。

1.2DNJ雙層滲透泵片的制備

1.2.1基本處方 在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定了基本處方，具體見表1。

表1 DNJ 雙層滲透片基本處方

1.2.2片芯的制備 DNJ雙層滲透泵片由片芯和包裹片芯的帶有釋藥孔的半透衣膜組成，其中片芯分別為含藥層和助推層。含藥層制備方法如下：按處方將藥物DNJ與輔料PEO(Mr6×106)、HPMC E50混合均勻，加水制成軟材，制備粒徑為0.7～0.8 mm的顆粒，烘干得A顆粒[10-11]。

助推層制備方法如下：按處方將輔料PEO(Mr6×106)、氯化鈉、HPMC E50混合均勻，加水制成軟材，制備粒徑為0.7～0.8 mm的顆粒，烘干得B顆粒。

將A顆粒和B顆粒分別加入滑石粉，采用單壓沖片機(jī)，10 mm淺凹沖，將含藥層和助推層壓制成雙層片芯[7]，片芯硬度為9 kg/cm2。

1.2.3包衣的制備 將CA 300 g溶于2 000 mL 50%乙醇中，然后再加入100 g的PEG 4000混合，攪拌2 h。在包衣鍋轉(zhuǎn)速為25 r/min，包衣液流量為7 mL/min，包衣床溫度45 ℃的條件下對(duì)DNJ雙層滲透泵片片芯進(jìn)行包衣[12]。控制包衣的質(zhì)量增率在3%，包衣后在45 ℃下干燥0.5 h。干燥后，將包衣片用激光打孔機(jī)打釋藥孔(孔徑0.6～0.7 mm)，即為DNJ雙層滲透泵片，含藥量40 mg/片。

1.3體外釋放度的測(cè)定

按《中國藥典》2015年版四部通則釋放度測(cè)定法第二法(槳法)測(cè)定[12]。溶出介質(zhì)水900 mL，轉(zhuǎn)速為50 r/min，在0.5、 1、 2、 4、 6、 8和12 h取適量溶液，以0.22 μm濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。取DNJ對(duì)照品，精密稱定，加水溶解并稀釋制成0.05 g/L DNJ作對(duì)照品溶液。精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各10 μL，注入HPLC色譜儀[9]，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算每片的釋放度。釋放度(r)公式如下：

r=Ai×Mr/Xr×40

式中:Ai—供試品峰面積;Mr—對(duì)照品稱樣量;Xr—對(duì)照品含量; 40為每片含40 mg 1-脫氧野尻霉素。

精密稱取1-脫氧野尻霉素對(duì)照品適量，分別加水制成質(zhì)量濃度為10、 20、 30、 40、 50和60 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以1-脫氧野尻霉素峰面積(A)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血藥質(zhì)量濃度(C,mg/L)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：C=1 214.5A-23.273，R2=0.998 9。在質(zhì)量濃度10～60 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4釋放度的影響因素考察

1.4.1含藥層HPMC E50用量 HPMC E50作為含藥層黏合劑，分別制備每片中羥丙基甲基纖維素E50用量為5、 10和15 mg的優(yōu)化處方后的DNJ雙層滲透泵片，分別取6片測(cè)溶出曲線。

1.4.2助推層PEO用量 PEO(Mr6×106)作為助推材料，分別制備每片中PEO(Mr6×106)用量為70、 80和90 mg的1-脫氧野尻霉素雙層滲透泵片，分別取6片測(cè)溶出曲線。

1.4.3包衣層CA用量 CA作為控釋成膜材料，分別制備每片中CA用量為10、 15和20 mg的優(yōu)化處方后的1-脫氧野尻霉素雙層滲透泵片，分別取6片測(cè)溶出曲線。

1.4.4包衣層PEG 4000用量 PEG 4000作為包衣層致孔劑，分別制備每片中PEG 4000用量為4、 5和6 mg的優(yōu)化處方后的DNJ雙層滲透泵片，分別取6片測(cè)溶出曲線。

1.4.5體外不同pH值溶出介質(zhì) 分別取6片優(yōu)化處方后的DNJ雙層滲透泵片以pH值1.2鹽酸鹽溶液、 pH值4.5醋酸鹽溶液和水為溶出介質(zhì)，測(cè)定溶出曲線。

1.5比格犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.5.1血樣的采集 取健康比格犬6只(雌雄各半)，隨機(jī)分為兩組，采用兩制劑兩周交叉進(jìn)行設(shè)計(jì)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，然后分別給藥DNJ速釋片及雙層滲透泵片(主藥用量為40 mg)，2次給藥間隔為1周。實(shí)驗(yàn)前，在Beagle犬靜脈處安置一支滯留針，給藥前取空白血樣，給藥后0.5、 1、 2、 3、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 18和24 h 取血3 mL，置于涂有肝素的離心管中，以3000 r/min離心15 min，取上層血漿，置于-20 ℃的冰箱里保存待測(cè)[13]。

1.5.2血漿樣品的處理和測(cè)定 精密吸取血漿1 mL置于10 mL具塞離心試管中，加0.1 mg羅紅霉素作為內(nèi)標(biāo)物，1 mol/L氫氧化鈉100 μL，渦旋混勻30 s，加入3 mL乙醚-二氯甲烷(體積比3∶2)，渦旋振搖5 min，3000 r/min離心15 min后，定量吸取有機(jī)層2.5 mL放入另一潔凈玻璃試管中，置于40 ℃恒溫水浴中用氮?dú)獯蹈?，氮?dú)獯蹈珊蟮臍堅(jiān)蛹状?00 μL渦旋30 s，復(fù)溶后精密吸取20 μL注入HPLC中進(jìn)行分析。

1.6分析測(cè)試方法

1.6.1高效液相色譜分析條件 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱的填充劑，柱溫為35 ℃，以0.05 mol/L醋酸銨溶液(pH值5.25±0.05)-乙腈(體積比47.5∶52.5)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為320 nm。

1.6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取DNJ對(duì)照品適量，分別加水制成質(zhì)量濃度為0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5和3.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取空白血漿1 mL，置于10 mL具塞離心試管中，分別加入DNJ系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，使血漿中的藥物濃度分別為0.05、 0.10、 0.15、 0.20、 0.25和0.30 mg/L。按1.5.2節(jié)操作，以DNJ峰面積(A)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血藥質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：C=1452.9A-14.753，R2=0.9981，在質(zhì)量濃度0.05～0.3 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與分析

2.1不同條件對(duì)體外釋藥性能的影響

2.1.1含藥層HPMC E50用量 HPMC E50作為含藥層黏合劑，分別制備每片中羥丙基甲基纖維素E50用量為5、 10和15 mg的雙層滲透泵片，取6片測(cè)定溶出曲線?？疾霩PMC E50用量對(duì)藥物釋放度的影響，結(jié)果見圖1。由圖可知，隨著雙層滲透泵片中HPMC E50用量從5 mg 增加到15 mg，溶出釋放變慢，這是由于HPMC為含藥層的黏合劑，用于增大藥物黏度，所以羥丙基甲基纖維素含量越高，藥物溶出越慢。而溶出速率太快，會(huì)使雙層滲透泵片的緩釋能力減弱，溶出太慢則會(huì)使溶出時(shí)間過長，因此溶出速率居中比較適宜(下同)。綜上，當(dāng)HPMC用量為10 mg時(shí)，藥物溶出速度最為適宜。

2.1.2助推層PEO用量 PEO作為助推材料，分別制備每片含PEO(Mr6×106)70、 80和90 mg的雙層滲透泵片，取6片測(cè)溶出曲線?？疾霵EO用量對(duì)藥物釋放度的影響，結(jié)果見圖2。

圖1 不同HPMC E50用量藥物溶出曲線Fig. 1 Drug dissolution curve with different dose of HPMC E50

圖2 不同PEO(Mr 6×106)用量藥物溶出曲線Fig. 2 Drug dissolution curve with different dose of PEO(Mr 6×106)

由圖2可以看出，隨著雙層滲透泵中PEO用量從70 mg增加到90 mg，吸水膨脹速度加快，推動(dòng)藥物的力量變大，釋放藥物的速度加快，即PEO用量越高溶出越快。當(dāng)PEO用量為80 mg時(shí)，藥物溶出速度最為適宜。

2.1.3包衣層CA用量 CA作為控釋成膜材料，分別制備每片含CA 10、 15和20 mg的雙層滲透泵片，取6片測(cè)釋放曲線?？疾霤A用量對(duì)藥物釋放度的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著雙層滲透泵片中的CA(控釋成膜材料)的用量從10 mg增加至20 mg，薄膜包衣層增厚，吸收水分速度變慢，助推層吸水膨脹速度變慢，推動(dòng)藥物力量變小，藥物溶出變慢，即CA用量越高溶出越慢。當(dāng)每片含CA用量為15 mg時(shí)，藥物溶出速度最為適宜。

2.1.4包衣層PEG 4000用量 PEG 4000作為包衣層的致孔劑，分別制備每片中PEG 4000用量為4、 5和6 mg的雙層滲透泵片，取6片測(cè)溶出曲線?？疾霵EG 4000用量對(duì)藥物釋放度的影響，結(jié)果見圖4。

圖3 不同CA用量藥物溶出曲線Fig. 3 Drug dissolution curve with different dose of cellulose acetate

圖4 不同PEG 4000用量藥物溶出曲線Fig. 4 Drug dissolution curve with different dose of PEG 4000

由圖4可知，隨著雙層滲透泵片中PEG 4000(包衣層的致孔劑)的用量從4 mg增至6 mg，控釋膜上空隙增多，藥物溶出加快，即PEG含量越高溶出越快。當(dāng)PEG 4000用量為5 mg時(shí)，藥物溶出速度最為適宜。

2.1.5pH值 分別取6片雙層滲透泵片，以pH值1.2鹽酸溶液(8.33 mL鹽酸溶解于水至1000 mL)、pH值4.0醋酸鹽溶液(醋酸和醋酸鈉質(zhì)量比為4.4∶1溶解于水至1000 mL)和水作為溶出介質(zhì)，計(jì)算每片的釋放度[14]，結(jié)果見圖5。

從圖5中可看出，DNJ雙層透泵片在pH值1.2、pH值4.0、水介質(zhì)(pH值7.0)中溶出速度基本一致，說明控釋層包衣功能良好，不受體內(nèi)pH值變化的影響。體內(nèi)pH值從胃部的酸性到水的中性的變化，不影響DNJ雙層滲透泵片藥物釋放的控釋效果。藥物12 h溶出完全，且全程近似恒速緩慢釋放。

2.2雙層滲透泵片在比格犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)

采用統(tǒng)計(jì)矩的非隔室動(dòng)力學(xué)理論對(duì)6只比格犬的血藥濃度進(jìn)行處理[15-16]，其中藥物釋放的峰質(zhì)量濃度(Cmax，μg/L)和達(dá)峰時(shí)間(tmax，h)均采用實(shí)測(cè)值。平均血藥濃度-時(shí)間曲線如圖6所示。速釋片與雙層滲透泵片主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。結(jié)果表明：速釋片的Cmax為(987.0±114.3) μg/L，雙層滲透泵片的Cmax為(478.1±88.7) μg/L，速釋片的最高血藥濃度約為雙層滲透泵片的2倍；雙層滲透泵片的tmax為(9.3±3.8) h與速釋片的tmax為(4.4±2.2) h相比tmax顯著延遲，達(dá)到了緩釋的目的。AUC0～24 h為血藥濃度-時(shí)間曲線下面積，由表2可以看出，速釋片與雙層滲透泵片數(shù)值接近，說明相對(duì)生物利用度相同，藥效一致。

圖5 1-脫氧野尻霉素在不同pH值介質(zhì)中溶出曲線Fig. 5 Dissolution curve of 1-deoxynojirimycin in medium with different pH value

圖6 比格犬口服DNJ速釋片和雙層滲透泵片后的經(jīng)時(shí)血藥濃度曲線(n=6)Fig. 6 Blood concentration and time curve of Beagle dogs after oral DNJ immediate release tablets and bi-layer osmotic pump tablets(n=6)

生物利用度是衡量藥物吸收速度和程度的綜合參數(shù)，是評(píng)價(jià)藥物制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)。以統(tǒng)計(jì)結(jié)果中的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積計(jì)算速釋片與雙層滲透泵片的相對(duì)生物利用度[17-18]，相對(duì)生物利用度的計(jì)算公式如下：

Fr=AUCT×DR/AUCR×DT×100%

式中：Fr—相對(duì)生物利用度，%； AUC—血藥濃度-時(shí)間曲線下面積，μg·h/L；D—給藥劑量，mg; T為雙層滲透泵片(40 mg/片)， R為速釋片(40 mg/片)。

與速釋片相比，DNJ雙層滲透泵片的相對(duì)生物利用度為(96.1±9.8)%，雙層滲透泵片與速釋片吸收程度生物等效，其90%置信區(qū)間為84.8%～103.7%。

表2 比格犬口服DNJ速釋片和雙層滲透泵片后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)

DNJ雙層滲透泵片在體外pH值1.2、pH值4.0和水介質(zhì)中溶出速度基本一致，說明控釋層包衣功能良好，不受pH值變化的影響，呈線性恒速釋放。在體內(nèi)DNJ雙層滲透泵片的tmax為(9.3±3.8) h與速釋片的tmax為(4.4±2.2) h相比顯著延遲，達(dá)到了緩控釋的目的。速釋片與雙層滲透泵片的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積AUC0～24 h的數(shù)值接近，說明相對(duì)生物利用度相同。說明體內(nèi)外藥物相關(guān)性良好。

3 結(jié) 論

3.1以釋放度為考核指標(biāo)，根據(jù)基礎(chǔ)配方優(yōu)化了DNJ雙層滲透泵片的處方，結(jié)果表明：在含藥層HMPC E50用量 10 mg，助推層PEO用量80 mg，包衣層CA用量15 mg及PEG 4000用量5 mg的條件下，藥物溶出速度最為適宜。

3.2體外釋藥實(shí)驗(yàn)表明，DNJ雙層滲透泵片的溶出不受介質(zhì)pH值的變化影響，藥物12 h溶出完全，且恒速緩慢釋放。

3.3通過比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究可知，DNJ雙層滲透泵片釋放的達(dá)峰時(shí)間(tmax)為(9.3±3.8) h比速釋片的tmax(4.4±2.2) h顯著延遲，達(dá)到了緩釋的目的；滲透泵片的相對(duì)生物利用度為(96.1±9.8)%，90%置信區(qū)間為84.8%～103.7%，與速釋片吸收程度生物等效。