■張少航 巫 攀 王啟軍 凌華云 蔣思婧* 張桂敏

（1.湖北大學生命科學院，湖北武漢430062；2.湖北華揚科技發(fā)展有限公司，湖北武漢438899）

博落回（Macleaya cordata）屬罌粟科多年生大型草本植物，又名落回、號簡草等，為野生有毒植物。博落回提取物和博落回散已被列為我國的二類新獸藥（農(nóng)業(yè)部公告第1597號，新獸藥注冊目錄），用于殺蟲和抑制腸道有害微生物。歐陽龍等的研究表明，豬每天給予小于5 mg/kg體重的博落回散是安全的；博落回提取物——血根堿在1999年被收入《飼料添加劑品種目錄》（農(nóng)業(yè)部公告195號），在此基礎上，一些研究小組進行了博落回散作為添加劑的飼喂研究。蔡鵬等的研究表明博落回散作為飼料添加劑，以15～24 mg/kg的劑量添加于斷奶的仔豬飼料中，有效的提高了仔豬的日采食量和日增重量，這表明小劑量的博落回散可以作為飼料添加劑使用。

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，可以平衡腸道微生物，減少有害微生物的定植。因此，益生菌可以作為優(yōu)良的飼料添加劑添加到畜禽飼料中，而飼料經(jīng)益生菌發(fā)酵后，不僅提高了飼料的利用率，而且發(fā)酵過程中還會產(chǎn)生多種維生素、活性小肽、氨基酸以及多種酶類等，可以促進禽畜的營養(yǎng)代謝，提高動物的生產(chǎn)性能和飼料的營養(yǎng)價值。

博落回散作為飼料添加劑，能有效地預防畜禽感染性疾病的發(fā)生，促進動物的健康生長。而益生菌添加于飼料中，不僅能提高動物對飼料的利用率、補充多種營養(yǎng)物質(zhì)，還能抑制腸道腐敗菌的生長。如果這兩類飼料添加劑能同時使用，不僅能預防疾病和平衡腸道微生物的生態(tài)環(huán)境，還能提高飼料的轉(zhuǎn)化率和養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)出，降低生產(chǎn)成本。但博落回散是否會影響飼料中益生菌的生長和正常的代謝？目前未見任何相關的研究報道。本文擬通過博落回散對飼料益生菌的抑制作用以及最小抑菌濃度分析，獲得博落回散與益生菌作為飼料添加劑同時添加使用的實驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥品

博落回散（湖南美可達生物資源有限公司）、MS培養(yǎng)基（北京陸橋集團有限公司，CM 188）、Tryptone（OXOID）、Yeast Extract（OXOID）、NaCl（中國醫(yī)藥集團有限公司）、Agar（Biosharp）等。

1.1.2 實驗菌株

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、嗜熱乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），實驗所用菌株均為本實驗室分離保藏。

1.1.3 實驗培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、酵母浸出粉5.0 g、NaCl 10.0 g、去離子水1 L，固體培養(yǎng)基中加入1.0%～1.5%的瓊脂。

MS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫1.0 ml、七水合磷酸氫二鉀2.0 g、三水合乙酸鈉5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、七水合硫酸鎂0.2 g、四水合硫酸錳0.05 g，加入去離子水1 L，固體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度的博落回散溶液的制備

稱取500 mg的博落回散溶于50 ml的無菌水中，配置成10 mg/ml的博落回散母液，按照比例分別稀釋成1、2、3、4、5、6 mg/ml的實驗所用博落回散溶液。將其儲存至4℃冰箱備用。

1.2.2 菌株的活化

將實驗室保存在-80℃的菌株置于冰上緩慢融化，其中鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌和屎腸球菌分別劃線于MS固體培養(yǎng)基上，地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌劃線于LB固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，分別接種于對應的MS液體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)18 h，備用。

1.2.3 博落回散抑菌實驗

平板抑菌圈實驗：分別吸取培養(yǎng)好的5 μl九種菌的菌懸液，與20 ml的固體培養(yǎng)基混合均勻后倒平板。待平板凝固后，每塊平板分別放入7個無菌牛津杯，向牛津杯中分別加入1～6 mg/ml的博落回散溶液，以加入等量無菌水作為對照，將標記好的平板置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察抑菌圈的大小并測量博落回散濃度為6 mg/ml時抑菌圈的直徑，每次實驗重復3次。

最低抑菌濃度（MIC）測定：分別取地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌5 μl的菌懸液，加入到5 ml的LB液體培養(yǎng)基或MS液體培養(yǎng)基中，向其中加入4 mg/ml的博落回散溶液 100、200、300 μl，用無菌水補至總體積一樣。鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌的菌懸液5 μl加入到5 ml的MS液體培養(yǎng)基中向其中加入10 mg/ml的博落回散溶液200、300、400 μl，用無菌水補至總體積一樣。同樣的方法將植物乳桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌接種后加入10 mg/ml的博落回散溶液400、500、600 μl，用無菌水補至總體積一樣。將所有試管置于37℃的搖床中培養(yǎng)18 h，觀察菌體生長情況。

2 結果

2.1 平板抑菌圈實驗結果

2.1.1 不同終濃度的博落回散溶液對9種菌的抑菌效果

不同終濃度的博落回散溶液對9種益生菌的生長產(chǎn)生了不同的抑菌效果（圖1）。從圖1中可以看出不同終濃度的博落回散溶液對同一種菌的抑制作用有明顯的差異。博落回散溶液的終濃度越高抑菌圈越明顯。此外，相同終濃度的博落回散溶液對不同種屬的益生菌的抑制效果也有明顯不同，抑菌圈直徑差異較大。當博落回散終濃度為1 mg/ml時明顯的抑制了地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌的生長，當博落回終濃度為3 mg/ml時，才會對鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，這說明地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌對博落回散溶液比較敏感。

圖1 不同濃度的博落回溶液對9種益生菌的抑制作用及抑菌圈的大小

2.1.2 抑菌圈直徑的測定

從抑菌平板可以看出，相同終濃度的博落回散溶液對不同種屬的益生菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑會有明顯的差別，通過抑菌圈直徑的大小可以直觀比較出6 mg/ml的博落回散溶液對九種益生菌抑制的程度。由測量可知6 mg/ml的博落回溶液對嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的抑菌圈直徑平均值分別為為9.6、10.3、15.0、10.0、6.3、11.5、11.3、21.0、21.0 mm，6 mg/ml的博落回溶液對枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的抑制作用最強，對植物乳桿菌的抑制作用最弱（圖2）。

圖2 6 mg/ml的博落回對不同種的益生菌抑菌圈直徑的大小

2.2 最小抑菌濃度的測定

通過最小抑菌濃度實驗分析博落回散溶液對不同種屬的益生菌的最小抑菌濃度（表1）。從表1可以看出地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌的最小抑菌濃度為150 μg/ml，干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌的最小抑菌濃度為580 μg/ml，鼠李糖乳桿菌的最小抑菌濃度為720 μg/ml，屎腸球菌、糞腸球菌的最小抑菌濃度為900 μg/ml，植物乳桿菌的最小抑菌濃度為1 080 μg/ml。此結果與平板抑菌直徑測量結果是吻合的，地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和嗜熱乳桿菌對博落回散溶液最敏感，其抑菌直徑是最大的。植物乳桿菌對博落回散溶液不是十分敏感，其抑菌圈直徑也最小。

表1 博落回溶液對所選的9種益生菌的最小抑菌濃度（MIC，x=∑xi/n，n=3）

3 討論

隨著世界范圍內(nèi)對抗生素濫用的重視以及禁止抗生素用作飼料添加劑，尋找具有天然抗菌活性且安全無污染的綠色飼料添加劑成為研究的重點。博落回散作為天然的抗菌劑越來越多的運用于禽畜的飼養(yǎng)中，大量研究表明博落回散作為飼料添加劑不僅有抗炎的作用[11]，而且可以提高母豬的日采食量和窩產(chǎn)仔數(shù)，降低仔豬的腹瀉率[12]；Khadem等研究表明在飲用水中添加博落回提取物可以降低肉雞的腹脂率以達到提高肉雞的品質(zhì)的目的。博落回散中的生物堿（包含血根堿和白屈菜紅堿等）是主要的抑菌活性成分，Li等研究表明博落回散中的血根堿（Sanguinarine）、白屈菜紅堿（Chelerythrine）具有抗菌殺菌活性，現(xiàn)代藥理研究表明博落回散作為獸藥具有消炎、抗癌的功效。

用益生菌發(fā)酵飼料已成為飼料行業(yè)的通用手段，益生菌發(fā)酵的飼料對維持禽畜的腸道菌群的平衡和生產(chǎn)性能方面有著顯著的增益作用。劉金萍等[16]研究表明益生菌發(fā)酵飼料對于仔豬腸道大腸桿菌有著明顯的抑制作用，對腸道益生菌起到了促進作用；鄧敦等報道顯示用乳酸菌發(fā)酵的飼料喂養(yǎng)仔豬能明顯提高仔豬的免疫力，提高仔豬的抗病能力。此外，益生菌發(fā)酵的飼料不僅可以提高飼料的利用率，且作為功能飼料適口性強，動物喜食。

飼料中添加益生菌已為養(yǎng)殖行業(yè)普遍接受，博落回散作為飼料添加劑尚在推廣過程中，這兩者能否同時使用呢？本研究旨在尋找博落回散的使用濃度和9種益生菌之間的協(xié)調(diào)互作的比例關系，研究結果表明：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌對博落回散最敏感，最小抑菌濃度為150 μg/ml，這個數(shù)值是博落回散作為飼料添加劑建議使用的終濃度（60 μg/ml）的2.5倍，而其他幾種菌的最小抑菌濃度更高；這說明博落回散溶液在規(guī)定的使用范圍內(nèi)（30～60 μg/ml）不會對常用的益生菌產(chǎn)生抑制作用。

本研究首次分析了博落回散溶液對常用飼料益生菌生長的影響，在推廣使用博落回散飼料添加劑方面提供了有力的支持，這對養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展也有積極的推動作用。