■ 韓國(guó)棟 劉曉蘭* 王 燕 易春霞 江成英 姜未公 王 松 劉 驥

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006）

隨著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展，蛋白質(zhì)飼料緊缺的問題日益突顯，然而，解決這一問題的主要途徑是開發(fā)新的飼料資源和合理利用現(xiàn)有的飼料資源；其中發(fā)酵蛋白飼料是提高蛋白利用率，減少蛋白資源匱乏的一個(gè)有效措施。玉米黃粉是玉米濕法淀粉生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，含有60%～65%（w/w）的蛋白質(zhì)，主要以醇溶蛋白為主，可溶性差，且氨基酸組成不平衡，適口性不好，直接作為飼料使用蛋白質(zhì)消化利用率低[1]。采用微生物發(fā)酵的方法可提高玉米黃粉蛋白的可溶性，相應(yīng)地提高玉米黃粉作為飼料的動(dòng)物消化利用率，對(duì)緩解蛋白質(zhì)飼料緊缺問題具有重要意義。

發(fā)酵玉米黃粉飼料有良好的營(yíng)養(yǎng)和功能性。鄭喜群等[2]用玉米黃粉發(fā)酵飼料飼喂鵪鶉，結(jié)果表明，試驗(yàn)組平均日增重、每周體重增重量和屠宰率均高于對(duì)照組。苗國(guó)偉[3]用發(fā)酵玉米黃粉飼喂肉雞，結(jié)果表明，試驗(yàn)組料重比明顯降低，盲腸中大腸桿菌數(shù)量明顯降低，乳酸菌數(shù)量顯著提高。Hodgkinson等（2000）[4]報(bào)道生長(zhǎng)豬回腸內(nèi)源氮的流量與日糧中寡肽的含量成正相關(guān)。這說明發(fā)酵后飼料對(duì)動(dòng)物蛋白吸收有良好改善作用。

本課題以玉米黃粉、豆粕和麩皮為生產(chǎn)原料，以枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌為主要菌種，嗜熱乳桿菌為輔助菌種，對(duì)固體發(fā)酵玉米蛋白飼料的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，最大限度地提高可溶性蛋白含量，降低發(fā)酵成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌和嗜熱乳酸菌均由齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院生物工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供；玉米黃粉由黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司提供；豆粕和麥麩均為市售。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RH-Q型全溫振蕩器：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；MVS-1旋渦混合器：北京金北德工貿(mào)有限公司；DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌器：上海申安有限責(zé)任公司；PYX-DHS-40×50-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱和101-1-BS-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；PB-10 pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 物料膨化

用雙螺桿膨化機(jī)分別膨化玉米黃粉、豆粕和麥麩。將玉米黃粉含水量調(diào)節(jié)為18%，豆粕含水量調(diào)節(jié)為16%，麥麩含水量調(diào)節(jié)為18%，放置過夜。膨化機(jī)的工作參數(shù)為160～180℃。1～1.5 MPa。膨化的玉米黃粉、豆粕和麩皮在室溫下干燥，用粉碎機(jī)粉碎，篩分，收集過40目膨化的玉米黃粉、豆粕和麥麩作為原料備用。

1.3.2 方法

粗蛋白含量、總氨基酸含量、粗脂肪含量、粗纖維含量、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、水分、粗灰分、鈣含量和磷含量分別采用中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6432—1994、GB/T 14965—1994、GB/T 6433—1994、GB/T 5009—2003、NY/T 1459-2007、GB/T 20806—2006、GB/T 6435—1986、GB/T 6438—1992、GB/T 6436—2002和 GB/T 6437—2002方法測(cè)定[5-14]，以干物質(zhì)為基礎(chǔ)計(jì)算測(cè)定結(jié)果?？扇苄缘鞍缀康臏y(cè)定方法采用福林酚法[15]；活菌總數(shù)測(cè)定采用平皿計(jì)數(shù)法。

1.3.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

斜面培養(yǎng)方法：將菌種從4℃冰箱取出，無菌操作，用接種環(huán)挑取培養(yǎng)物置于相應(yīng)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)36～48 h，作為斜面菌種。

種子培養(yǎng)基：PDA改良培養(yǎng)基（1 L馬鈴薯液、20 g葡萄糖、18 g麥芽糖、5 g硫酸銨、5 g氯化鉀、5 g硫酸鎂、5 g氯化鈉、pH自然）、LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)方法：將活化好的斜面菌種接入培養(yǎng)基中（250 ml三角瓶裝量 60 ml），180 r/min培養(yǎng) 36～48 h，作為種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)基：黃粉35%、豆粕35%、麥麩30%、尿素0.5%、硫酸銨1%、糖蜜1%，加水至初始含水量45%。

發(fā)酵培養(yǎng)方法：將培養(yǎng)的種子液接入單向發(fā)酵袋中（5 kg規(guī)格發(fā)酵袋裝料2.5 kg），室溫培養(yǎng)4～15 d，作為發(fā)酵物。

2 結(jié)果與討論

2.1 物料原料配伍

從營(yíng)養(yǎng)角度考慮，物料原料配伍后的蛋白質(zhì)含量要滿足動(dòng)物需要，各種氨基酸含量要豐富，組成要平衡；從物料成本考慮，玉米黃粉價(jià)格高于豆粕，豆粕價(jià)格高于麩皮；從發(fā)酵成本考慮，麩皮價(jià)格低廉，一般每千克價(jià)格不高于2元，其作為膨松劑使用便于好氧微生物發(fā)酵的通風(fēng)控制，同時(shí)它也屬于能量飼料，麩皮中的淀粉可為微生物提供碳源；為了合理配伍發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，將所用的玉米黃粉、豆粕、麩皮進(jìn)行基本成分分析，其結(jié)果見表1。

表1 飼料原料的主要成分及含量（干基%）

由表1可知，這三種飼料原料中含有較豐富的可供微生物發(fā)酵利用的碳源、氮源和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以作為微生物的基質(zhì)發(fā)酵利用，但這三種原料各有特點(diǎn)。黃粉中含有60%以上的蛋白質(zhì)，粗纖維含量較少，鈣、磷含量較高；麩皮粗淀粉和磷含量最高，可為微生物提供碳源和礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；豆粕營(yíng)養(yǎng)較為均衡，但粗淀粉和磷含量低。進(jìn)一步又分析了這三種原料的氨基酸組成，結(jié)果如表2所示。

表2 飼料原料的氨基酸含量（%）

由表2可知玉米黃粉中的支鏈氨基酸和中性氨基酸含量相當(dāng)高，但其氨基酸組成不平衡，而Lys嚴(yán)重不足，而大豆粕剛好含有較高的Lys含量。合理物料配比可以使氨基酸組成更加平衡，且物料配比是微生物能否充分發(fā)酵利用的關(guān)鍵，也是影響發(fā)酵成本的主要因素。為了合理調(diào)整物料配比，在原物料配比黃粉35%、豆粕35%和麩皮30%基礎(chǔ)上，對(duì)物料進(jìn)行了膨化預(yù)處理，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，僅膨化黃粉時(shí)物料疏松度和通風(fēng)效果更好，發(fā)酵物中的可溶性蛋白含量由75.3 mg/g（未膨化）提高到94.6 mg/g（膨化），此時(shí)對(duì)發(fā)酵更有利。因此，選取了膨化的黃粉35%、豆粕35%和麩皮30%作為原料。

2.2 固態(tài)發(fā)酵

2.2.1 接種量的確定

出于對(duì)種子培養(yǎng)成本的考慮，在原混菌比例為枯草芽孢桿菌∶啤酒酵母菌∶嗜熱乳桿菌=1∶1∶1基礎(chǔ)上，做了預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)混菌比例為枯草芽孢桿菌∶啤酒酵母菌∶嗜熱乳桿菌=4∶4∶1時(shí)，發(fā)酵效果較好，發(fā)酵物醇香味最濃厚，活菌數(shù)最高達(dá)3.67×107CFU/g（濕基）。在發(fā)酵時(shí)間為4 d，溫度30℃，物料比例為膨化的玉米黃粉∶豆粕∶麥麩=7∶7∶6的條件下，考察接種量1%、2%、5%、10%對(duì)固體發(fā)酵的影響，其結(jié)果見圖1。

圖1 接種量對(duì)可溶性蛋白的影響

從圖1中可以看出在實(shí)驗(yàn)的接種量范圍內(nèi)，各接種量條件均可以使發(fā)酵物可溶性蛋白顯著提高，接種量對(duì)發(fā)酵物中可溶性蛋白含量的影響不大。結(jié)果表明，該物料配伍和菌株混合比例的條件下，可以采用1%的低接菌量，這在工業(yè)生產(chǎn)條件下使得種子培養(yǎng)負(fù)擔(dān)小。

2.2.2 含水量的確定

含水量對(duì)固態(tài)發(fā)酵有較大的影響，菌群在發(fā)酵飼料時(shí)需要一定的水分，初始含水量的增加，可以通過增加發(fā)酵底物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解和微生物代謝產(chǎn)物的擴(kuò)散來促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)（Gervais等1996）[16]。水分太多會(huì)降低發(fā)酵能力；同時(shí)，也會(huì)造成發(fā)酵底物多孔性的降低，影響氧氣和熱量的傳遞；水分太低也會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)生可溶性蛋白含量的能力。在發(fā)酵時(shí)間為4 d，混菌比例為枯草芽孢桿菌∶啤酒酵母菌∶嗜熱乳桿菌=4∶4∶1，溫度30℃，接種量1%，物料比例為膨化的玉米黃粉∶豆粕∶麥麩=7∶7∶6的條件下，考察物料含水量（ml/g干基）0.4、0.6、0.8、1.0對(duì)固體發(fā)酵的影響，其結(jié)果見圖2。

圖2 料水比對(duì)可溶性蛋白的影響

從圖2中可以看出在實(shí)驗(yàn)的含水量范圍內(nèi)，含水量對(duì)發(fā)酵物中可溶性蛋白含量影響較大，當(dāng)每克物料（干基）加入0.8 ml水時(shí)，發(fā)酵物可溶性蛋白含量最高，其可溶性蛋白含量為97.24 mg/g。

2.2.3 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度是影響固態(tài)發(fā)酵的一個(gè)重要因素，因?yàn)槲⑸锏纳L(zhǎng)和代謝都是在各種酶的催化下進(jìn)行的，溫度是保證酶活性的重要條件（Raghavarao等，2003）[17]。可溶性蛋白含量的增加與酶有較大關(guān)系，從酶動(dòng)力學(xué)來看，溫度越高反應(yīng)速度越快，發(fā)酵過程中微生物生長(zhǎng)量加快，而酶很容易因高溫而失活。因此，發(fā)酵溫度的確定很關(guān)鍵。在發(fā)酵時(shí)間為4 d，混菌比例為枯草芽孢桿菌∶啤酒酵母菌∶嗜熱乳桿菌=4∶4∶1，含水量0.8 mg/kg，物料比例為膨化的玉米黃粉∶豆粕：麥麩=7∶7∶6的條件下，考察溫度26、28、30、32℃對(duì)固體發(fā)酵的影響，其結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)可溶性蛋白的影響

從圖3中可以看出培養(yǎng)溫度30℃時(shí)，發(fā)酵物的可溶蛋白含量最高，培養(yǎng)溫度32℃時(shí)次之，接種溫度28℃時(shí)最低，接種溫度26℃時(shí)居中，初步確定最優(yōu)溫度為30℃。結(jié)果表明，發(fā)酵的最適溫度可能跟三種菌株各自的適宜的生長(zhǎng)溫度有關(guān)；而常用的飼用芽孢桿菌和乳酸菌適宜生長(zhǎng)溫度是30～37℃，常用的飼用酵母菌適宜的生長(zhǎng)溫度是24～32℃。綜合考慮，可以選用30℃的發(fā)酵溫度。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間的確定

發(fā)酵時(shí)間是多菌種組合固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的主要參數(shù)，也是影響發(fā)酵效果的重要因素，其長(zhǎng)短取決于發(fā)酵過程中微生物生長(zhǎng)量、微生物本身的特性及微生物所分泌酶的酶解效率。在接種量1%，含水量0.8 mg/kg，混菌比例為枯草芽孢桿菌∶啤酒酵母菌∶嗜熱乳桿菌=4∶4∶1，溫度30℃，物料比例為膨化的玉米黃粉∶豆粕∶麥麩=7∶7∶6的條件下，考察發(fā)酵時(shí)間4、5、7、11、15 d對(duì)固體發(fā)酵的影響，其結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)可溶性蛋白的影響

由圖4可以看出，最佳的發(fā)酵時(shí)間為7 d。此時(shí)玉米蛋白飼料中可溶性蛋白含量由59.09 mg/g（發(fā)酵前）提高到103.55 mg/g。發(fā)酵時(shí)間過短，微生物能利用養(yǎng)料繼續(xù)增殖，產(chǎn)物釋放不完全，發(fā)酵不徹底，不能去除培養(yǎng)基中的抗?fàn)I養(yǎng)因子及生成足量的多肽；如果發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)，由于微生物自身新陳代謝，需要消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，則營(yíng)養(yǎng)損失大。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間為7 d。

2.2.5 發(fā)酵玉米蛋白飼料常規(guī)成分分析

成分分析是飼料鑒定的基礎(chǔ)，準(zhǔn)確地測(cè)量飼料中的成分是提高飼料利用率和有效地控制質(zhì)量的關(guān)鍵。通過對(duì)發(fā)酵物的常規(guī)成分分析可以更好地評(píng)價(jià)其價(jià)值和品質(zhì)；發(fā)酵對(duì)玉米黃粉飼料常規(guī)成分含量的變化如表3、表4所示。

由表3可以看出，混菌發(fā)酵玉米黃粉飼料使其中的營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生了變化，發(fā)酵后可溶性蛋白明顯提高。

玉米黃粉飼料發(fā)酵前后水分、粗脂肪和磷含量差異顯著（P＜0.05），分別提高了 6.09%、10.53%和10.64%；粗蛋白質(zhì)、粗纖維和粗淀粉含量差異顯著（P＜0.05），分別降低了10.13%、42.87%和20.56%；其他組分無顯著差異（P＞0.05）。發(fā)酵后進(jìn)一步提高了玉米蛋白復(fù)合物飼料的品質(zhì)和飼用價(jià)值。

表3 玉米黃粉飼料發(fā)酵前后的營(yíng)養(yǎng)成分（%）

表4 發(fā)酵前后底物的氨基酸組成（%）

由表4可以看出發(fā)酵后比發(fā)酵前氨基酸總量有所降低，但實(shí)際的可溶蛋白含量卻增加了，同時(shí)也解釋了粗蛋白降低的原因；由此推測(cè)可能微生物生長(zhǎng)需要一定的養(yǎng)分，消耗了部分氨基酸，代謝產(chǎn)出了游離氨基酸。

3 結(jié)論

以玉米黃粉、大豆粕和麥麩為發(fā)酵底物，得到發(fā)酵的玉米蛋白飼料。實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的最適發(fā)酵底物組成是：膨化的黃粉∶豆粕∶麩皮=7∶7∶6，發(fā)酵底物加水量0.8 ml/g物料；適宜的發(fā)酵條件為接種量1%，溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間7 d，結(jié)果表明，玉米蛋白飼料中可溶性蛋白含量由59.09 mg/g（發(fā)酵前）提高到103.55 mg/g（發(fā)酵后）；而其中粗纖維跟粗淀粉含量分別降低了42.87%和20.56%。在此背景下，混菌固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料可以取代仔豬日糧中10%到20%的豆粕，還可以作為營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)劑使用，是飼料原料的充分補(bǔ)充，其具有發(fā)酵成本低、營(yíng)養(yǎng)利用率高、無抗生素使用等優(yōu)點(diǎn)，是家禽類養(yǎng)殖企業(yè)的新選擇。隨著發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，發(fā)酵飼料的品質(zhì)也將逐步提升，這也將對(duì)其工業(yè)化生產(chǎn)有一定的借鑒意義。