■管國強 方 華 王美娟 畢 芳 崔鳳杰* 孫中超 朱校適 郭子好

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江蘇鹽城源耀生物科技有限公司，江蘇鹽城224000；3.北京中醫(yī)大學東方學院中西醫(yī)結(jié)合臨床教研室，河北廊坊065001）

嗜熱細菌和真菌是潛在的生產(chǎn)耐熱木聚糖酶菌株[4-5]。如熱袍菌屬的海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)可產(chǎn)生分子量分別為120 000和40 000的耐熱β-1,4-木聚糖酶[6]。另外，嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilium）、嗜熱棉毛菌（Thermomyces lanuginosus）、嗜熱擬青霉（Paecilomyces thermophila）和嗜熱側(cè)孢霉（Thermophilic sporotrichum）等嗜熱真菌也已被證實可產(chǎn)耐熱木聚糖酶[7-8]。通常，營養(yǎng)成分（如培養(yǎng)基的組成、濃度水平等）和培養(yǎng)條件（如發(fā)酵溫度、時間、接種量、通氣、攪拌等）直接影響真菌木聚糖酶的表達和分泌[9]。因此，為提高嗜熱真菌產(chǎn)酶水平，了解菌株生長和產(chǎn)酶效率之間的關(guān)系，需對其發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行系統(tǒng)優(yōu)化。在木質(zhì)纖維素原料中，由于木聚糖酶與半纖維素木聚糖分子間存在著空間位阻，使得木聚糖酶與底物不能充分接觸，當同時存在纖維素酶與木聚糖酶時，木聚糖酶的空間阻礙明顯減小，因此可顯著提高半纖維素的水解效率[10]。

目前國內(nèi)外關(guān)于嗜熱子囊菌產(chǎn)木聚糖酶的文獻主要集中在其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化與控制等方面。例如，Jain等[11]在德里大學南校區(qū)土壤中篩選得到T.aurantiacusRCKK，在優(yōu)化的固態(tài)培養(yǎng)條件下，CMC酶活、FPA、β-葡萄糖苷酶酶活和Xyn酶活均達到最大值，分別為88、15.8、25.3 U/g和6 543 U/g。周秀梅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，T.aurantiacus的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Xyn最大活性可達10 321 U/g；而龐宗文等[13]篩選到T.aurantiacusQS7-2-4在優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵條件下，Xyn活性達到27 952 U/g。

本課題組前期采用稀釋涂布、剛果紅染色以及胞外酶活測定等步驟篩選到產(chǎn)耐熱木聚糖酶的菌株，經(jīng)形態(tài)學、ITS序列同源性和系統(tǒng)進化樹等分析確定其為嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacusCGMCC11334）[14-15]，并單因素實驗優(yōu)選其產(chǎn)木聚糖酶的條件為：初始pH值4.5、接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、培養(yǎng)溫度45℃、培養(yǎng)時間8 d。然而，關(guān)于嗜熱子囊菌深層發(fā)酵產(chǎn)耐熱木聚糖酶及其水解能力的條件仍需進一步系統(tǒng)研究。因此，本文在前期研究的基礎(chǔ)上，采用正交實驗和主成分分析構(gòu)建綜合水解能力指數(shù)，并優(yōu)化所產(chǎn)木聚糖酶最大水解玉米芯能力時的培養(yǎng)基組成，以期為獲得最大化產(chǎn)酶條件及其應(yīng)用于農(nóng)副產(chǎn)物水解生產(chǎn)寡聚木糖等方面提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

T.aurantiacusCGMCC11334由江蘇大學生物工程研究所選育，專利保存中國普通微生物菌種保藏管理中心。

種子培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖15.0、小麥蛋白胨4.0、KH2PO41.0、Na2HPO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、微量元素1.0 ml/l[微量元素營養(yǎng)液（g/l）：FeSO4·7H2O 5.0、Mn-SO4·H2O 1.6、ZnSO4·7H2O 1.4、CoCl2·6H2O 3.7]，自然pH值。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/l）：麩皮10.0、小麥蛋白胨1.0、酵母膏1.0、KH2PO42.0、CaCl20.3、(NH4)2SO41.4、MgSO4·7H2O 0.3、吐溫-80 1.0 ml，微量元素1.0 ml/l[微量元素營養(yǎng)液（g/l）：FeSO4·7H2O 5.0、MnSO4·H2O 1.6、ZnSO4·7H2O 1.4、CoCl2·6H2O 3.7]。

1.2 培養(yǎng)方法

T.aurantiacus經(jīng)活化后，切取5 mm×5 mm的新鮮菌塊置于PDA培養(yǎng)基上，于45℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d；接入5塊5 mm×5 mm菌塊于種子培養(yǎng)基（裝液量為100 ml/250 ml）中，45 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d，制得種子液；將種子液按10%（v/v）的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床（45℃，180 r/min）培養(yǎng)8 d。

1.4 正交實驗設(shè)計

根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果[14-15]，選取麩皮、微晶纖維素、牛肉浸膏、玉米漿、小麥蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、CuSO4、FeSO4和VB1作為自變量，設(shè)計一個10因素5水平共50組實驗的正交實驗表L50(510)，分別測定Xyn、FPA、CMC活性和總的還原糖得率，實驗設(shè)計的因素水平見表1，采用正交實驗設(shè)計助手和SPSS17.0對正交實驗結(jié)果進行分析。

表1 實驗設(shè)計的因素水平(g/l)

1.5 分析方法

1.5.1 酶活測定

FPA活性的測定[16]。設(shè)空白組：1.5 ml pH值4.8的緩沖液；底物對照組：1.5 ml pH值4.8的緩沖液+50 mg濾紙條；酶對照組：1.0 ml pH值4.8的緩沖液+0.5 ml粗酶液；實驗組：1.0 ml pH值4.8的緩沖液+50 mg濾紙條+0.5 ml粗酶液。將空白組、對照組和實驗組同時放入50oC水浴鍋中保溫60 min，反應(yīng)結(jié)束后，立即加入3.0 ml DNS混勻，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫。取0.2 ml反應(yīng)物加2.5 ml水稀釋，在540 nm處測吸光度值，用空白組調(diào)零。

CMC酶活的測定。設(shè)空白組：1.5 ml pH值4.8的緩沖液；底物對照組：1.0 ml CMC溶液+0.5 ml pH值4.8的緩沖液；酶對照組：0.5 ml酶液+1.0 ml pH值4.8的緩沖液；實驗組：1.0 ml CMC溶液+0.5 ml酶液。將底物對照組、酶對照組和實驗組三組試管同時放入50oC水浴鍋中水浴30 min，水浴結(jié)束后，立即加入3.0 ml DNS混勻，沸水浴5 min，冷卻至室溫。取0.2 ml混合物加2.5 ml水稀釋，然后在540 nm處測吸光度值，用空白管調(diào)零。

Xyn活性的測定[17]。設(shè)空白組：2.0 ml pH值5.3的緩沖液；底物對照組：1.0 ml木聚糖溶液+1.0 ml pH值5.3的緩沖液；酶對照組：1.0酶液+1.0 ml pH值5.3的緩沖液；實驗組：1.0 ml木聚糖溶液+1.0 ml粗酶液；將底物對照組、酶對照組和實驗組3組試管同時置于50℃水浴30 min，水浴結(jié)束后。立即加入3.0 ml DNS混勻，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫，加蒸餾水稀釋至25 ml。然后在540 nm處測吸光度，用空白管調(diào)零。

在一定的溫度及pH值條件下，每毫升酶液，每分鐘水解相應(yīng)底物，產(chǎn)生1 μmol還原糖（葡萄糖/木糖），定義為一個酶活力單位(U)。

1.5.2 糖得率的測定

甜玉米（黃色）購自江蘇旅游超市（鎮(zhèn)江江大店），去除籽粒，將玉米芯置于60℃的烘箱中烘至恒重，用小型的粉碎機將烘干后的玉米芯粉碎，過40目篩保存?zhèn)溆?。?jīng)測定[18]，玉米芯含有38%的半纖維素，35%的纖維素，22%的木質(zhì)素以及少量的灰分。

發(fā)酵液水解玉米芯糖得率的測定步驟主要包括：將粉碎后的玉米芯在60℃的熱水中浸泡12 h，使其充分的溶脹，取殘渣烘干；將烘干的玉米芯按1∶25（w/v）加入水解反應(yīng)體系（24 ml pH值5.3的檸檬酸鹽緩沖液和1.0 ml酶液），于50 ℃、200 r/min反應(yīng)4 h；采用DNS法測定上清液中還原糖的含量（以木糖計，mg/ml）[19]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有實驗的數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3次，采用Excel 2007統(tǒng)計分析軟件處理，結(jié)果以“平均值±標準差（X±SD）”表示；利用Origin 8.6繪制曲線。

2 .結(jié)果與分析

2.1 主成分提取法構(gòu)建木聚糖酶綜合水解能力指數(shù)

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，設(shè)計了以麩皮、微晶纖維素、牛肉浸膏、玉米漿、小麥蛋白胨、KH2PO4、Mg-SO4、CuSO4、FeSO4和VB1等10個因素為自變量，Xyn、CMC和FPA酶活這3個指標為因變量的正交實驗L50(510)，實驗結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果L50(510)

表2 （續(xù)） 正交實驗結(jié)果L50(510)

玉米芯的主要成分包括木聚糖、纖維素和少量的木質(zhì)素。纖維素的水解可以增加木聚糖酶和木聚糖的接觸面積，同時降低纖維素對木聚糖酶的非反應(yīng)性吸附，從而增加木聚糖的水解，因此在制備高活性的木聚糖酶時，同時適當增加纖維素酶的活性有利于提高以玉米芯為底物的還原糖得率。下面以Xyn、CMC和FPA酶活性及其交互作用為變量，采用主成分提取法構(gòu)建木聚糖酶綜合水解能力指數(shù)（XCHI）。

首先利用SPSS軟件對三種酶的獨立作用及交互作用等9個變量進行相關(guān)性分析，得到各變量之間的相關(guān)系數(shù)矩陣。由表3可知，有多個變量間存在著顯著的相關(guān)關(guān)系，因此可以進行主成分分析，對9個變量進行縮減。

表3 變量間相關(guān)系數(shù)矩陣

為了進一步確證主成分分析的可行性，對實驗數(shù)據(jù)進行了KMO檢驗和Bartlett球形度檢驗。由表4可知，取樣足夠度的Kaiser-Meyer-Olkin，KMO值為0.774，大于0.7；Bartlett球形度檢驗結(jié)果顯示，近似卡方值為1 043.246，說明取樣量充足，差異極顯著(P＜0.01)，這兩項檢驗結(jié)果證明這9個變量間存在著相關(guān)關(guān)系，因此適合做主成分分析。

表5顯示有3個主成分的特征根大于1，因此可以提取三個主成分，這三個主成分的累積貢獻率達到98.821%，因此說明這三個主成分的解釋率達到98.8%。

表4 KMO和Bartlett檢驗

表5 因子的特征值與累積貢獻率

經(jīng)過方差最大正交旋轉(zhuǎn)后的載荷矩陣見表6。旋轉(zhuǎn)后，矩陣結(jié)構(gòu)簡化，含義明確。主成分1主要用于解釋Xyn、CMCXyn、FPAXyn和XynXyn；主成分 2在CMC、FPACMC、CMCXyn和CMCCMC上有較大的載荷；而主成分3則可以用來代替FPA和FPAFPA的作用，說明提取的這三個主成分完全可以用來解釋9個變量。

表6 旋轉(zhuǎn)后的載荷矩陣

根據(jù)成分得分系數(shù)矩陣（表7），可得到每個主成分的方程式：

其中，X1是指FPA酶活的作用，X2指CMC酶活的作用，X3指Xyn酶活的作用，X4指FPA酶活與CMC酶活間的交互作用，X5指FPA酶活與Xyn酶活間的交互作用，X6指CMC酶活與Xyn酶活間的交互作用，X7指FPA酶活內(nèi)部的交互作用，X8指CMC酶活內(nèi)部的交互作用，X9指Xyn酶活內(nèi)部的交互作用。

根據(jù)每個主成分的貢獻率以及總的貢獻率可得到關(guān)于綜合水解能力的方程XCHI=(66.848×F1+18.762×F2+13.217×F3)/98.821=0.676×F1+0.190×F2+0.134×F3。將每組實驗得到的9個變量的數(shù)值代入方程即可用XCHI表示。

表7 成分得分系數(shù)矩陣

2.2 XCHI適用性驗證

為了檢驗XCHI的適用性，實驗以XCHI為自變量，發(fā)酵液水解玉米芯的總還原糖得率為因變量，進行回歸分析（見表8）。模型擬合的結(jié)果見表9，相關(guān)系數(shù)R為0.937，說明綜合水解能力A可以很好的解釋最終的總還原糖得率，解釋率高達97.3%。R2與調(diào)整R2的值很接近，分別為0.878和0.873，說明模型擬合的較好。

方差分析結(jié)果見表10，F(xiàn)值為169.119，P＜0.05，說明該回歸模型達到極顯著水平，具有統(tǒng)計學意義。

表8 綜合水解能力

表9 模型的構(gòu)建

表10 擬合模型方差分析結(jié)果

表11 模型中各系數(shù)的檢驗結(jié)果

由表11可知，常數(shù)項和各系數(shù)項均顯著，最終得到糖得率與綜合水解能力XCHI的回歸方程，Y=10.824+0.032XCHI+(-7.328×106)XCHI2，而二次項系數(shù)極小，因此可以忽略。該結(jié)果說明XCHI可以作為指數(shù)用于優(yōu)化木聚糖酶水解玉米芯能力的綜合指數(shù)。

2.3 以XCHI為指標優(yōu)化合成最大木聚糖酶活性的最適條件(見表12)

驗證結(jié)果表明，建立的模型具有良好的可行性。因此，以XCHI為響應(yīng)值，對50組正交實驗進行直觀分析，得到10個因素的影響力大小依次為D＞A＞J＞F＞E＞G＞H＞B＞C，確定木聚糖酶水解活性最大的培養(yǎng)基組成為A5B2C5D4E5F3G5H1I2J4，即麩皮16 g/l、微晶纖維素7 g/l、牛肉浸膏4 g/l、玉米漿3 g/l、小麥蛋白胨4 g/l、KH2PO41.0 g/l、MgSO42.0 g/l、CuSO40.00 g/l、FeSO40.05 g/l、VB10.15 g/l。在優(yōu)化的條件下，Xyn、CMC和FPA的酶活分別為135.12、1.95 U/ml和1.68 U/ml；分別比優(yōu)化前提高了291.3%、33.8%和165.4%，經(jīng)計算XCHI為1 649.44。

表12 綜合水解能力的直觀分析

3 結(jié)論

本文利用單因素實驗優(yōu)選了耐熱菌株產(chǎn)木聚糖酶的條件，在此基礎(chǔ)上，比較系統(tǒng)地采用正交實驗和主成分分析構(gòu)建綜合水解能力指數(shù)和優(yōu)化所產(chǎn)木聚糖酶最大水解玉米芯能力時的培養(yǎng)基組成為（g/l）：麩皮16、微晶纖維素7、牛肉浸膏4、玉米漿3、小麥蛋白胨4、KH2PO41.0、MgSO42.0、CuSO40.00、FeSO40.05 和VB10.15。在此條件下，Xyn、CMC和FPA的活性分別為135.12、1.95 U/ml和1.68 U/ml，XCHI為1 649.44，為獲得最大化產(chǎn)酶條件及其應(yīng)用于農(nóng)副產(chǎn)物水解生產(chǎn)寡聚木糖等方面提供一定的技術(shù)支持。