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Aβ1?42寡聚體對(duì)小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞D1a IL?1β表達(dá)水平的影響研究

2018-12-29 02:24:20王鼎李曉紅李亞惠大連醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院遼寧大連116044大連醫(yī)科大學(xué)附屬友誼醫(yī)院遼寧大連116001
現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生 2018年24期
關(guān)鍵詞:寡聚體老年斑性反應(yīng)

王鼎,李曉紅,李亞惠(1.大連醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院,遼寧大連116044;.大連醫(yī)科大學(xué)附屬友誼醫(yī)院,遼寧大連116001)

阿爾茨海默病(AD)又稱(chēng)老年性癡呆,是老年人群常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病之一,主要臨床表現(xiàn)包括漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變及語(yǔ)言障礙等。近年來(lái),AD發(fā)病率逐漸升高,且患者病死率隨著年齡增加逐步增高[1]。AD神經(jīng)病理學(xué)改變主要包括腦組織中存在大量的β-淀粉樣蛋白(Aβ)構(gòu)成的老年斑,以及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)由tau蛋白過(guò)度磷酸化和聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)[2]。AD發(fā)病原因及機(jī)制尚未完全明確。炎癥因子通過(guò)誘發(fā)腦組織炎性反應(yīng),進(jìn)而誘發(fā)AD,可能是其發(fā)病機(jī)制之一[3-5]。白細(xì)胞介素(IL)-1是重要的炎癥因子,其家族包括IL-1α、IL-1β、IL-18及IL-1受體蛋白拮抗劑等,其中IL-1β與AD關(guān)系密切。IL-1β主要由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和釋放,通過(guò)作用于其他細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),最終引起神經(jīng)病理學(xué)改變,促進(jìn)AD發(fā)生、發(fā)展[6]。細(xì)胞外的Aβ可通過(guò)激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致一系列的炎性反應(yīng),進(jìn)而誘發(fā)AD[7]。然而,Aβ是否可以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β尚未明確。小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞D1a具有星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征,活化后可通過(guò)分泌炎癥因子參與局部免疫反應(yīng)。因此,本研究以D1a細(xì)胞為研究對(duì)象,結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法,分析了 Aβ1~42 寡聚體(Aβ1-42)與 IL-1β的相關(guān)性,旨在確定Aβ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Allegra X-30R型低溫離心機(jī)(Beckman Coulter公司,美國(guó)),Mini-ProteinⅡ型電泳儀、iMark型酶標(biāo)儀、Gel Doc 2000型凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國(guó)),CO2培養(yǎng)箱(ThermoFisher公司,美國(guó)),TCSSP8型熒光共聚焦顯微鏡(Leica公司,德國(guó))。

1.1.2 試劑 Aβ1-42寡聚體(Sigma公司,美國(guó)),小鼠βactin、IL-1β 抗體(Cell Signaling Technology公司,美國(guó)),Alexa Fluor?488羊抗鼠IgG抗體(Abcam公司,美國(guó))。胎牛血清、Dulbecco′s改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)/高糖培養(yǎng)基(Invitrogen)、胰蛋白酶(Invitrogen公司,美國(guó)),二甲基亞砜(DMSO,Sigma公司,美國(guó)),聚偏二氟乙烯膜、標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)記物(New England Biolabs公司,美國(guó)),一抗剝脫液、抗熒光淬滅劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,中國(guó)上海),XAR膠片及曝光、顯影系統(tǒng)(OneXyi公司,加拿大)。二辛可寧酸(BCA)法蛋白檢測(cè)試劑(康為世紀(jì)生物科技有限公司,中國(guó)北京),電化學(xué)發(fā)光法(ECL)蛋白檢測(cè)試劑盒(Pierce公司,美國(guó)),實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)試劑盒(Omega、Promega公司,美國(guó)),霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶(S-P)超敏鼠/兔IgG檢測(cè)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,中國(guó)福州)。D1a細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組與處理 根據(jù)噻唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定Aβ1-42寡聚體處理細(xì)胞最適濃度為0.2 μg/mL。因此,將D1a細(xì)胞分為對(duì)照組和Aβ1-42寡聚體處理組。對(duì)照組給予2 μL DMSO處理。Aβ1-42寡聚體處理組給予Aβ1-42寡聚體處理,Aβ1-42寡聚體終濃度為 0.2 μg/mL。各組細(xì)胞藥物處理時(shí)間均為24 h。采用標(biāo)準(zhǔn)6孔板進(jìn)行細(xì)胞接種、培養(yǎng)和處理,每組3孔,且處理實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 蛋白檢測(cè) (1)蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè):以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞后,刮取細(xì)胞至滅菌的離心管中,4℃、10 000r/min離心5 min,棄上清,按比例加入蛋白裂解液,冰上裂解1 h;4°C、15 000 r/min離心15 min,取上清用于蛋白檢測(cè)。以10%十二烷基環(huán)酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白檢測(cè)樣品,4℃轉(zhuǎn)膜過(guò)夜,5% 脫脂奶粉封閉,IL-1β 抗體(1∶200)4℃孵育過(guò)夜,二抗室溫孵育2 h,ECL檢測(cè)后進(jìn)行XAR膠片曝光、顯影。洗膜重新封閉后,β-actin抗體(1∶10 000)4°C 孵育過(guò)夜,二抗室溫孵育 2 h,膠片曝光顯影。以β-actin作為蛋白檢測(cè)參照標(biāo)準(zhǔn)。(2)免疫熒光染色和激光共聚焦掃描檢測(cè):PBS沖洗細(xì)胞,4%甲醛固定30 min,0.3%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)處理30 min,室溫下加入羊血清預(yù)孵育30 min,IL-1β抗體(1∶200)4°C 孵育過(guò)夜。pH7.4、0.01mol/L PBS沖洗后,以羊抗兔 IgG 抗體(1∶200)室溫孵育 1 h,封片,激光共聚焦掃描顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果并拍照。另采用4,6二脒基-2-苯吲哚(DAPI)進(jìn)行細(xì)胞核染色。

1.2.3 mRNA檢測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)方法提取處理細(xì)胞總RNA,采用qRT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行IL-1β mRNA檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,雙側(cè)檢驗(yàn),P<0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白和mRNA檢測(cè)結(jié)果 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Aβ1-42寡聚體處理組D1a細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Aβ1-42寡聚體處理組D1a細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),見(jiàn)圖1。

2.2 激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果 激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果顯示,Aβ1-42寡聚體處理組IL-1β表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)圖2。

3 討 論

目前,AD發(fā)病原因及機(jī)制尚未明確,腦組織慢性持續(xù)性炎性反應(yīng)可導(dǎo)致神經(jīng)組織病理學(xué)改變,因此被認(rèn)為是誘發(fā)AD和疾病持續(xù)進(jìn)展的主要因素[8]。在多種因素的作用下,機(jī)體產(chǎn)生和釋放大量炎癥因子,誘發(fā)非特異性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性炎性反應(yīng),進(jìn)而誘發(fā)AD。值得注意的是,炎性反應(yīng)同時(shí)可引起Aβ在腦組織中大量沉積并逐漸形成老年斑,而老年斑的沉積最終使腦組織急性損傷轉(zhuǎn)變?yōu)槁該p傷,最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。因此,抑制炎癥因子的產(chǎn)生和釋放、拮抗Aβ參與炎性反應(yīng)對(duì)AD的防治十分重要。

圖1 Western blot與qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖2 激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果

存在于腦組織細(xì)胞外的Aβ是腦內(nèi)淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)在β-和γ-分泌酶的裂解作用下產(chǎn)生的肽段,通常以單體、二聚體、低聚物和纖維狀等多種形式存在,其中纖維狀A(yù)β是主要的神經(jīng)毒性致病物質(zhì)。纖維狀A(yù)β大量沉積是AD發(fā)病的根本原因[9]。然而,也有研究表明,可溶性Aβ寡聚體也具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用[10-11]。

在早期A(yíng)D患者及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腦內(nèi),Aβ老年斑沉積可刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化并立即和Aβ結(jié)合,進(jìn)而降解、清除Aβ老年斑[12]。然而,隨著AD病情不斷進(jìn)展,在致炎因素的長(zhǎng)期作用下,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥因子。此外,星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞間炎性反應(yīng)信號(hào)傳遞過(guò)程中相互影響,小膠質(zhì)細(xì)胞在吞噬、清除Aβ老年斑及釋放炎癥因子的同時(shí),可以激活星型膠質(zhì)細(xì)胞,活化后的星型膠質(zhì)細(xì)胞參與清除Aβ,并同時(shí)通過(guò)分泌炎癥因子抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性[13]。在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的炎癥因子中,對(duì)IL-1的研究較多,已證實(shí)在A(yíng)D患者受損的大腦皮層中,IL-1表達(dá)水平顯著升高,而且Aβ老年斑周?chē)罨男∧z質(zhì)細(xì)胞IL-1表達(dá)水平也升高[14]。IL-1β作為IL-1主要的亞基之一,可通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)-p38信號(hào)通路,上調(diào)β-淀粉樣蛋白裂解酶1(BACE1)表達(dá)水平,進(jìn)而加速APP的裂解和促進(jìn)Aβ沉積[15-16]。IL-1β還可通過(guò)活化膠質(zhì)細(xì)胞,誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生和釋放,產(chǎn)生神經(jīng)毒性;通過(guò)促進(jìn)tau蛋白的磷酸化,通過(guò)MAPK-p38信號(hào)通路介導(dǎo)神經(jīng)纖維纏結(jié)[17]。

綜上所述,炎性反應(yīng)在A(yíng)D發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有著至關(guān)重要的作用。Aβ不僅直接介導(dǎo)炎性反應(yīng),其持續(xù)存在還可活化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,釋放更多的細(xì)胞因子參與炎性反應(yīng),使AD病理學(xué)改變處于惡性循環(huán)之中,最后導(dǎo)致AD的發(fā)生和發(fā)展。本研究以體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Aβ1-42寡聚體可上調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β表達(dá)水平,驗(yàn)證了Aβ1-42寡聚體與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β表達(dá)水平二者間的相關(guān)性,為進(jìn)一步探索Aβ和炎性反應(yīng)在A(yíng)D發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中的作用奠定了一定的基礎(chǔ)。

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