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(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 ，濟(jì)寧 272067)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一組累及腸道的慢性非特異性炎癥疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn’s disease,CD)。其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，但有研究表明，機(jī)體多種免疫成分在IBD的發(fā)病過程中扮演著十分重要的角色，如T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤以及IL-6、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的大量分泌[1-3]。目前我國UC發(fā)病率明顯高于CD，UC患病率在近10年里顯著增加[4]。

IL-16是一種免疫分子，在多種細(xì)胞生命活動(dòng)和疾病發(fā)生中起重要作用，與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏性哮喘、腎移植等有密切的關(guān)系，有數(shù)據(jù)顯示IL-16在IBD患者體內(nèi)高表達(dá)[5]。目前，IL-16在IBD中的作用和功能尚不明確。本文擬利用惡唑酮誘導(dǎo)建立小鼠IBD模型，觀察IL-16在IBD中的表達(dá)水平，進(jìn)一步探究IL-16在IBD中的作用和功能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物與分組 C57BL/6小鼠，雌性，7周齡，體重約18g，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SPF級飼養(yǎng)。20只C57BL/6小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組和模型組,各10只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2試劑器材 惡唑酮(Sigma公司)；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；SYBR Green MasterMix(美國Vazyme公司)；IL-16 ELISA試劑盒(武漢華美公司)。

1.2 方法

1.2.1IBD模型的建立及標(biāo)本采集 小鼠腹腔注射3% 戊巴比妥鈉致麻，暴露小鼠背部皮膚0.2cm×0.2cm，分別在第1、2天用0.2ml的3%惡唑酮(溶于100%乙醇中)涂擦皮膚致敏1次，對照組用100%乙醇涂抹皮膚，5d后將直徑約1.5mm細(xì)導(dǎo)管插入小鼠肛門約4cm處，100μl 1%惡唑酮(溶于100%乙醇中)灌腸，注入后捏緊肛門倒置小鼠約1min，以便藥液與結(jié)腸充分接觸，對照組同樣做100%乙醇處理，待麻醉清醒后正常喂養(yǎng)，7d后重復(fù)灌腸1次。7d后眼球取血處死小鼠，75%乙醇浸泡消毒5min，置動(dòng)物于解剖臺，固定四肢，剪開腹壁暴露腹腔分離全結(jié)腸，沖洗干凈內(nèi)容物保存樣本。

1.2.2HE染色 取部分結(jié)腸組織沖洗干凈內(nèi)容物，卷起固定于4%多聚甲醛，經(jīng)脫水透明、浸蠟包埋、切片、脫蠟染色等步驟制作HE染色組織切片。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取部分結(jié)腸組織剪碎，加入5ml 0.01%膠原酶中37℃溫箱孵育1.5h，1500rpm離心5min收集細(xì)胞，加入700μl Trizol提取總RNA，RevertAid FirstStand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按照說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參對照，引物序列如下：

IL-16

上游引物：5’-AGTGAGAACCAT AGCCATACA-3’

下游引物：5’-ACCCAGGAGACCAGAAAA-3’

GAPDH

上游引物：5’-CTAGAG AGCTGACAGTGGG-TAT-3’

下游引物：5’-AGACGACCAATGCGTCCAAA-3’

1.2.4ELISA檢測 取部分結(jié)腸組織剪碎加入500μl RIPA強(qiáng)裂解液中，強(qiáng)烈渦旋充分裂解后14000rpm離心5min，取上清，使用IL-16的ELISA試劑盒檢測其在結(jié)腸組織中的濃度，按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠體重變化、全結(jié)腸長度及結(jié)腸HE染色情況

與正常對照組相比，惡唑酮誘導(dǎo)模型組小鼠體重從第4天開始顯著降低且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，造模期間模型組小鼠便血較為嚴(yán)重，解剖分離小鼠全結(jié)腸可見模型組小鼠結(jié)腸充血、水腫，糞便不成顆粒狀。鏡下觀察小鼠結(jié)腸HE染色切片，模型組小鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞脫落、糜爛和潰瘍形成，杯狀細(xì)胞減少，腸腺萎縮或消失，密度減低。見圖1。

注：A.小鼠造模期間體重變化及體重變化曲線；B.兩組小鼠全結(jié)腸照片；C.兩組小鼠部分結(jié)腸制作切片HE染色，200×鏡下觀察組織損傷;與正常對照組相比，*P<0.05。

圖1 兩組小鼠體重變化，全結(jié)腸長度及結(jié)腸HE染色情況

2.2 兩組小鼠結(jié)腸IL-16的表達(dá)情況

與正常對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織IL-16 mRNA水平表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.80，P<0.05)。與正常對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-16蛋白水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=44.62，P<0.05)。見圖2。

注：A.兩組小鼠結(jié)腸組織IL-16 mRNA表達(dá)；B.兩組結(jié)腸組織中IL-16蛋白水平的變化；與正常對照組相比，*P<0.05。

圖2 兩組小鼠結(jié)腸IL-16及IL-16 mRNA的表達(dá)情況

3 討論

惡唑酮誘導(dǎo)的IBD模型小鼠結(jié)腸炎是一種IL-4介導(dǎo)的以一種IL-4/IL-5細(xì)胞因子表達(dá)量升高為主的Th2型炎癥，其組織學(xué)特征主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞缺失導(dǎo)致糜爛和淺潰瘍的形成，杯狀細(xì)胞和腺體密度降低，黏膜和黏膜下層可見多種炎性細(xì)胞浸潤，惡唑酮誘導(dǎo)的炎癥性腸炎這些特征與人類IBD患者最相似[6]。因此，我們利用惡唑酮誘導(dǎo)小鼠腸炎模型來探究IBD的病因和發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供依據(jù)。

IL-16不僅可以作為一種T細(xì)胞的趨化因子、對T細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用[7]，還可以趨化活化的單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞[8]，IL-16還參與急性間質(zhì)性腎炎的發(fā)生發(fā)展[9]。目前已有臨床報(bào)道顯示IBD患者血清中IL-16異常表達(dá)[10]。研究表明，IBD尤其是UC的發(fā)病過程中T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、骨髓來源的抑制性細(xì)胞[11]等免疫細(xì)胞均發(fā)揮重要的生理作用。由此，本文主要觀察IL-16在炎癥性腸病是否通過調(diào)控某種或多種免疫細(xì)胞從而參與炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展過程。

本文結(jié)果顯示建模過程中IBD模型小鼠較正常對照組小鼠體重逐漸下降且從第4天開始小鼠伴隨腹瀉和便血，全結(jié)腸HE染色也顯示經(jīng)典的腸炎損傷，這表明惡唑酮誘導(dǎo)的IBD模型成功建立。隨后我們發(fā)現(xiàn)IBD模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-16 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均具有顯著性的增強(qiáng)，說明IL-16的高表達(dá)可能參與小鼠IBD的發(fā)病。已有的研究中提及IL-16主要由T細(xì)胞分泌作用于自身或趨化其他免疫細(xì)胞參與炎癥的發(fā)生發(fā)展，提示IL-16對IBD模型中效應(yīng)細(xì)胞具有一定的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究采用惡唑酮成功誘導(dǎo)小鼠IBD模型，并發(fā)現(xiàn)IL-16在惡唑酮誘導(dǎo)的IBD模型小鼠全結(jié)腸組織中高表達(dá)，但是IL-16參與IBD中的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，這是我們接下來進(jìn)一步的研究方向。