史洲銘，陳雪忠，劉志東，曲映紅

(1 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2 上海首源生物技術(shù)有限公司，上海 201101； 3 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

南極磷蝦(EuphausiasuperbaDana)是一種資源量巨大的戰(zhàn)略性海洋生物資源，蛋白質(zhì)含量高且符合聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)定義的優(yōu)質(zhì)蛋白，開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景廣闊。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員圍繞南極磷蝦蛋白的制備、生物活性肽等開(kāi)展了較多研究。但關(guān)于南極磷蝦蛋白功能特性改善的研究尚較少[1]。研究表明，南極磷蝦蛋白作為一種新來(lái)源的動(dòng)物性蛋白，其功能特性與已經(jīng)商品化的蛋白(如大豆蛋白、乳清蛋白等)的功能特性還存在較大差距，應(yīng)用性能較差，極大地限制了其在不同領(lǐng)域的應(yīng)用[2]。

食品蛋白良好的功能特性是其工業(yè)化應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。目前，食品蛋白的改性方法主要有物理改性、化學(xué)改性和生物改性等方法。食品蛋白的酶法改性具有反應(yīng)條件溫和、特異性強(qiáng)、節(jié)能環(huán)保和安全性高的特點(diǎn)，已經(jīng)成為食品蛋白功能特性改進(jìn)的重要方法之一。研究表明：酶解可改變食品“原始蛋白”的空間結(jié)構(gòu)和氨基酸序列，暴露蛋白基團(tuán)內(nèi)部“隱藏”的特定基團(tuán)；酶解改性不僅能夠顯著改變?nèi)榈鞍住⒋蠖沟鞍?、大米蛋白等的功能特性，而且其?yīng)用領(lǐng)域也得到了很好的拓展，提升了其應(yīng)用價(jià)值[3-6]。

關(guān)于南極磷蝦蛋白酶解對(duì)其功能特性影響的研究報(bào)道目前較少。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以食品蛋白的功能特性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，開(kāi)展酶解對(duì)南極磷蝦蛋白功能特性影響的研究，以期為南極磷蝦蛋白功能特性的改進(jìn)、應(yīng)用領(lǐng)域的拓展提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦由上海開(kāi)創(chuàng)遠(yuǎn)洋漁業(yè)有限公司2016年11月于南極設(shè)得蘭群島海域捕獲，-18 ℃冷凍運(yùn)回國(guó)內(nèi)，-84 ℃貯存?zhèn)溆谩A性蛋白(≥20 U/mg)、中性蛋白酶(≥100 U/mg)、胰蛋白酶(≥50 U/mg)、木瓜蛋白酶(≥800 U/mg)等來(lái)自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司；大豆油購(gòu)于上海市楊浦區(qū)卜蜂蓮花超市；其他化學(xué)試劑均為分析純級(jí)等，來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGl-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司)，PRO250勻漿器(美國(guó)Pro Scientific公司)，BM255攪拌機(jī)(美的集團(tuán)有限公司)，UV-8100可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 南極磷蝦蛋白的制備

參照高飛等[7]的方法。制備流程：冷凍南極磷蝦→室溫解凍→加水(料液比1∶3)→勻漿(3 min)→調(diào)節(jié)pH至5.5→離心(10 000 r/min，10 min)→回收上清液→調(diào)節(jié)pH至11.5→離心(10 000 r/min，10 min)→取沉淀→調(diào)節(jié)pH至7.0→真空冷凍干燥(-52 ℃)→南極磷蝦蛋白粉(-80℃貯存)。

1.3.2 南極磷蝦蛋白的酶解

參照燕夢(mèng)雅等[8]的方法酶解南極磷蝦蛋白。按照南極磷蝦蛋白與水之比(1 g∶20 mL) 配制底物，調(diào)節(jié)溶液至所用酶的最適pH和溫度，加入蛋白酶酶解；酶解液100 ℃、滅酶 5 min；冷卻至室溫，4 ℃、1×104g，離心25 min后收集上清液，噴霧干燥，測(cè)定其水解度。

1.3.3 南極磷蝦蛋白水解度的測(cè)定

南極磷蝦蛋白的水解度(DH)測(cè)定采用pH-state法[9]，該法的原理是基于蛋白水解過(guò)程中為保持體系pH恒定而加入堿/酸的量。因此，通過(guò)加入堿/酸的量來(lái)計(jì)算水解度：

(1)

式中：MDH—南極磷蝦蛋白水解度，%；C—消耗NaOH溶液物質(zhì)的量濃度，mol/L，本試驗(yàn)中采用1 mol/L氫氧化鈉溶液；V—所用NaOH溶液的體積，mL；mp—底物蛋白的質(zhì)量，g；htot—底物蛋白的肽鍵含量，mmol/g，本試驗(yàn)中南極磷蝦蛋白的htot為4.27 mmol/g；α—蛋白的氨基解離度，可以通過(guò)如下公式計(jì)算。

(2)

(3)

式中：pH—酶解過(guò)程中體系的pH；T—水解過(guò)程的絕對(duì)溫度；pK—解離常數(shù)。

1.3.4 蛋白酶篩選試驗(yàn)

根據(jù)酶的專一性及規(guī)?；褂玫默F(xiàn)實(shí)可行性及成本確定試驗(yàn)用酶。選取中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶作為備選用酶，在其最適酶解溫度和pH的條件下，按照南極磷蝦蛋白∶水(1 g∶20 mL)，酶與底物比3 %，酶解時(shí)間4 h進(jìn)行酶解，以南極磷蝦蛋白酶解物的水解度為指標(biāo)篩選蛋白酶。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

根據(jù)蛋白酶篩選試驗(yàn)的結(jié)果，根據(jù)所選酶的最適pH開(kāi)展單因素試驗(yàn)。南極磷蝦蛋白與水之比為1 g∶20 mL。各因素的水平梯度為：酶與底物比分別為2.5%、3.0%、3.5%和4.0 %，溫度分別為40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃，時(shí)間分別為2.5 h、3 h、4.0 h和4.5 h。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用Design-export軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)，以南極磷蝦蛋白的水解度為因變量，以溫度(A)、酶與底物比(B)和時(shí)間(C)3個(gè)因素為自變量，研究因素水平對(duì)南極磷蝦蛋白水解度的影響(表1)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.4 功能特性評(píng)價(jià)方法

1.4.1 吸水性(WAC)

100 mg/mL南極磷蝦蛋白、南極磷蝦蛋白酶解物溶液，室溫下放置1 h后體積記為V1；離心(5 000 g、25 ℃、30 min)，50 mL離心管傾斜45°保持10 min，倒出上清液，上清液體積記為V2。樣品的吸水性采用每g樣品吸收水的體積表示[10]。

WAC=(V1-V2)/W0

(4)

式中：WAC—吸水性，mL/g；V1—室溫下放置1 h后體積，mL；V2—保持10 min，倒出上清液，上清液體積，mL；W0—樣品質(zhì)量,g。

1.4.2 吸油性(OAC)

稱取 0.10 g南極磷蝦蛋白、南極磷蝦蛋白酶解物與1 mL大豆油，旋渦混勻 2 min，室溫下放置30 min后體積記為V1；離心(13 600 g、25 ℃、10 min)，50 mL離心管傾斜45度保持20 min，倒出上清液，上清液體積記為V2。樣品的吸油性采用每g樣品吸收油的體積表示[11]。

OAC=(V1-V2)/W0

(5)

式中：OAC—吸油性，mL/g；W0—樣品質(zhì)量,g。

1.4.3 乳化性指數(shù)(EAI)及乳化穩(wěn)定性(ES)

稱取1 mg/mL的南極磷蝦蛋白、南極磷蝦蛋白酶解物溶液30 mL和10 mL大豆油混合，體系的pH調(diào)整至7.0；室溫均質(zhì)1 min，靜置15 min。從由乳濁液底部吸取50 μL液體，與5 mL、0.10 % SDS(十二烷基磺酸鈉)(W/V)溶液充分混勻，以0.10 % SDS溶液作為空白。在波長(zhǎng)500 nm處分別測(cè)定吸光度A0，A15。EAI和ESI計(jì)算公式[11]：

(6)

(7)

式中：XEAI—乳化性指數(shù)，m2/g ；XESI—乳化穩(wěn)定性，%；0.25為油相體積分?jǐn)?shù)；C—蛋白濃度，g/mL；Δt-靜置時(shí)間(15 min)，10 000是比色皿光徑的換算數(shù)，2.303為經(jīng)驗(yàn)常數(shù)；A0和A15為乳狀液在0和15 min時(shí)，波長(zhǎng)500 nm處的吸光值。

1.4.4 起泡性(FC)及泡沫穩(wěn)定性(FS)

1 mg/mL的南極磷蝦蛋白、南極磷蝦蛋白酶解物溶液120 mL，采用1.00 mol/L鹽酸和NaOH溶液分別溶液調(diào)節(jié)pH 7.0。吸取20 mL溶液以10 000 r/min均質(zhì)1 min；將溶液倒入100 mL量筒，分別記錄0、30 min時(shí)的泡沫體積V0和V30。分別按照下式計(jì)算起泡性(FC)和泡沫穩(wěn)定性(FS)[11]。

(8)

(9)

式中：XFC—起泡性；XFS—泡沫穩(wěn)定性；V0—0 min時(shí)泡沫體積；V30—30 min時(shí)泡沫體積。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶篩選試驗(yàn)結(jié)果

選取木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶作為酶解用酶，以南極磷蝦蛋白酶解物的水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別在其最適條件下對(duì)南極磷蝦蛋白進(jìn)行酶解(圖1)。

圖1 不同酶對(duì)南極磷蝦蛋白水解度的影響

南極磷蝦蛋白的木瓜蛋白酶酶解物水解度明顯高于其他蛋白酶的酶解物，最大水解度為31.48 %；然后依次是堿性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解物。木瓜蛋白酶是一種底物特異性內(nèi)切酶，屬巰基蛋白酶，作用位點(diǎn)廣泛，已經(jīng)用于多種蛋白酶解并獲得功能特性較好的酶解產(chǎn)物[12]。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶作為實(shí)驗(yàn)用酶。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)南極磷蝦蛋白酶解物水解度的影響

在酶與底物比3.5 %，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間分別為3.5、4、4.5、5和5.5 h的條件下，分別測(cè)定南極磷蝦蛋白酶解物的水解度，以確定酶解時(shí)間對(duì)蛋白水解度的影響(圖2)。

水解度隨著反應(yīng)的進(jìn)行而提高，當(dāng)達(dá)到某點(diǎn)后水解度增加變緩；此后，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度保持相對(duì)穩(wěn)定并呈下降趨勢(shì)。分析原因可能是由于反應(yīng)初期蛋白質(zhì)在酶作用下，反應(yīng)進(jìn)程較快。在0～3.5 h時(shí)，水解度增加較快；反應(yīng)4 h時(shí)水解度達(dá)到最大；此后，南極磷蝦蛋白酶解反應(yīng)進(jìn)程減慢，宏觀表現(xiàn)為蛋白水解度降低。此時(shí)南極磷蝦蛋白的酶解過(guò)程處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[13]。因此，考慮到實(shí)際操作的可行性，酶解時(shí)間4 h較合適。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)南極磷蝦蛋白水解度的影響

2.2.2 酶與底物比對(duì)南極磷蝦蛋白酶解物水解度的影響

在酶解溫度50 ℃，酶與底物比分別為2.5%、3.0%、3.5%和4.0%，酶解時(shí)間4 h的條件下，分別測(cè)定南極磷蝦蛋白酶解物的水解度(圖3)。水解度隨著酶與底物比的增加而增加，酶與底物比在3.5%時(shí)水解度達(dá)到最大；此后，繼續(xù)增加酶與底物比，水解度保持相對(duì)穩(wěn)定并呈下降趨勢(shì)[14]。此外，用酶量的增加并沒(méi)有明顯增加水解度但會(huì)提高生產(chǎn)成本。因此，綜合考慮成本和實(shí)際生產(chǎn)需要，確定實(shí)驗(yàn)用酶與底物比為3.5%。

圖3 酶與底物比對(duì)南極磷蝦蛋白水解度的影響

2.2.3 酶解溫度對(duì)南極磷蝦蛋白酶解物水解度的影響

在酶與底物比3.5 %，酶解時(shí)間4.0 h，酶解溫度分別為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃的條件下，分別測(cè)定南極磷蝦蛋白酶解物的水解度(圖4)。由圖4可知，最大水解度出現(xiàn)在50 ℃。酶解溫度的升高會(huì)導(dǎo)致酶的變性失活、部分蛋白鏈斷裂成水溶性的亞基或肽，宏觀表現(xiàn)水解度降低。隨著酶解溫度的升高，水溶性的亞基或肽含量增加，抑制了南極磷蝦蛋白酶解物的進(jìn)一步水解[15]。因此，綜合考慮實(shí)際情況，選擇50 ℃作為最適酶解溫度。

圖4 酶解溫度對(duì)南極磷蝦蛋白水解度的影響

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以A(酶解溫度)、B(酶與底物比)和C(酶解時(shí)間)為自變量，以DH(南極磷蝦蛋白水解度)為因變量，采用Design Expert軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化南極磷蝦蛋白的酶解條件(結(jié)果見(jiàn)表2)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-export 軟件對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，獲得酶解對(duì)南極磷蝦蛋白水解度影響的回歸模型：DH=32.34+1.80×A+1.28×B+1.40×C-0.20×A×B-0.35×A×C-0.45×B×C-2.75×A2-2.84×B2-2.54×C2。

表3 回歸方程的方差分析

由表3可以看出，在因素交互項(xiàng)中，溫度與時(shí)間、溫度和酶與底物比的交互作用最為顯著，即此項(xiàng)交互作用對(duì)南極磷蝦蛋白的水解度影響明顯。根據(jù)回歸方程，利用Design-export分析軟件進(jìn)行溫度、酶與底物比、時(shí)間兩兩因子間的響應(yīng)面分析圖和等高線圖，酶解南極磷蝦蛋白時(shí)，溫度、酶與底物比和時(shí)間之間交互作用對(duì)南極磷蝦蛋白水解度的影響(圖5)。

研究表明，響應(yīng)面分析的等高線與響應(yīng)面圖能夠直觀深入地反映自變量之間的交互作用。橢圓形等高線表示兩種自變量交互作用顯著，而圓形等高線則表示兩種自變量交互作用不顯著。從圖5可以看出，溫度與酶與底物比和酶與底物比與時(shí)間之間交互作用非常顯著，直觀表現(xiàn)為等高線圖為橢圓形，優(yōu)化條件下酶解南極磷蝦蛋白水解度的結(jié)果為：溫度49.86 ℃，酶與底物比3.41%，時(shí)間4.03 h。

2.4 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)所得回歸方程的合理性和有效性，在實(shí)驗(yàn)因素水平范圍內(nèi)對(duì)該回歸方程進(jìn)行驗(yàn)證。該回歸方程在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)獲得的木瓜蛋白酶酶解南極磷蝦蛋白的最佳工藝為：酶與底物比3.41 %、時(shí)間4.03 h、溫度49.86 ℃；此條件下南極磷蝦蛋白水解度的預(yù)測(cè)值為32.40 %?？紤]現(xiàn)實(shí)操作的可行性，優(yōu)化南極磷蝦蛋白的最佳酶解工藝：酶與底物比3.4 %、時(shí)間4.0 h、溫度50 ℃，優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的水解度為(32.12 ± 1.46) %，與預(yù)測(cè)值的誤差為0.87 %。結(jié)果表明該回歸方程在一定范圍內(nèi)能夠有效預(yù)測(cè)木瓜蛋白酶酶解南極磷蝦蛋白的水解度。

圖5 交互作用對(duì)南極磷蝦蛋白酶解物水解度影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.5 酶解對(duì)南極磷蝦蛋白功能特性的影響

從南極磷蝦蛋白酶解物的功能特性結(jié)果(表6)可知，南極磷蝦蛋白酶解物的吸水性、泡沫穩(wěn)定性和乳化性等較南極磷蝦蛋白明顯增強(qiáng)，酶解南極磷蝦蛋白的吸油性和起泡性下降。食品蛋白的乳化性和溶解性之間通常呈正相關(guān)關(guān)系[16]。研究表明，隨著蛋白水解度的提高，酶解產(chǎn)物的吸水性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性增加。但過(guò)度的水解反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致蛋白分子間會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)烈的交聯(lián)作用，會(huì)降低蛋白表面黏度，導(dǎo)致吸油性、泡沫穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性的下降[17-20]。因此，應(yīng)該根據(jù)不同的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)δ蠘O磷蝦蛋白的水解度進(jìn)行靶向性控制，實(shí)現(xiàn)南極磷蝦蛋白的特定功能特性最優(yōu)化。

表6 酶解對(duì)南極磷蝦蛋白功能特性的影響

3 結(jié)論

以南極磷蝦蛋白酶解物的水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選確定木瓜蛋白酶作為實(shí)驗(yàn)用酶；基于單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化南極磷蝦蛋白的最適酶解條件：酶與底物比為3.41 %、時(shí)間為4.03 h、溫度為49.86 ℃，構(gòu)建了水解度預(yù)測(cè)回歸方程?？紤]到實(shí)際操作的可行性，確定實(shí)驗(yàn)條件下木瓜蛋白酶酶解南極磷蝦蛋白的最優(yōu)工藝為：酶與底物比為3.4 %、酶解時(shí)間4.0 h、酶解溫度50 ℃。在此條件下南極磷蝦蛋白酶解物的預(yù)測(cè)水解度最高(32.40 %)，與驗(yàn)證值(32.12 %)具有較好的一致性。南極磷蝦蛋白及其酶解物的功能特性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，酶解能改善南極磷蝦蛋白的功能特性，有助于南極磷蝦蛋白附加值的提升和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展。

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