羅東鳳 葉一農(nóng) 勞小榮

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是21世紀全球重要的公共健康問題之一。目前肝組織活檢是診斷非酒精性單純性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的金標準, 但因其存在侵入性, 在臨床上難以廣泛開展, 故尋找合適的無創(chuàng)診斷方法具有重要意義。本研究通過分析NAFLD患者血清細胞角蛋白18(Cytokeratin18,CK18)-M65和CK18-M30水平, 探討其無創(chuàng)診斷NAFLD的價值?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月～2017年12月在本院經(jīng)肝活組織檢查證實的21例成年(≥18周歲)NAFL或者NASH患者作為脂肪肝組, 選取同期本院體檢中心體檢的23例健康人作為正常對照組。排除標準［1］：每周飲酒量＞140 g(男性)或70 g(女性)；其他可導(dǎo)致肝脂肪變的疾病, 如病毒性肝炎、藥物性肝病、全胃腸外營養(yǎng)、肝豆狀核變性及自身免疫性肝??；肝移植患者；合并終末期疾病或惡性腫瘤；FibroScan檢測失敗；拒絕簽署知情同意書。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 對所有研究對象的身高、體質(zhì)量, 高血壓、糖尿病及酒精消耗史等進行記錄。BMI=體質(zhì)量/身高2(kg/m2)。肝活組織檢查前1 d抽空腹靜脈血, 完成肝臟生物化學指標、血糖、血脂等測定(日本日立7180型全自動生化分析儀)。CK-18檢測采用M65及M30定量檢測酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(蘇州和銳醫(yī)藥科技有限公司, 批號HR0320171001、HR0220170901)。

1.2.2 肝臟病理學檢查 采用美國巴德18G穿刺針在超聲引導(dǎo)下完成經(jīng)皮肝穿刺, 獲取約1.5～2.0 cm肝組織。穿刺肝組織迅速置入中性甲醛溶液固定, 并進行脫水, 石蠟包埋,切片并進行 蘇木精(HE)、膠原纖維(Masson)及網(wǎng)狀纖維染色。由2名有經(jīng)驗的病理專家進行組織學獨立評分, 不得參考患者信息, 當評分出現(xiàn)不一致時, 則需達成共識。參照《美國國立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)病理工作組指南》［2］進行活動度評分(NAS)和纖維化分期。

1.2.3 FibroScan測定 使用FibroScan-502機型(法國Echosens公司)M型探頭完成LSM及肝臟CAP測定。探頭頻率固定在3.5 MHz, 結(jié)果分別以kPa及dB/m表示。由獲得FibroScan操作者證書的醫(yī)生定人定機操作?；颊呖崭? 取仰臥位, 右手置于大腦后面, 以最大限度擴展肋間隙, 檢測區(qū)域選擇右側(cè)腋前線至腋中線第7、第8、第9肋間隙。選擇與肝活組織檢查相同部位檢測。每例研究對象成功檢測LSM在10次以上, 所有測量值的四分位間距(IQR)與中位數(shù)的比值(IQR/med)＜30%并且成功率(成功率檢測次數(shù)/總檢測次數(shù))≥60%為有效測量。未符合要求視為失敗。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。各組數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗(Shapiro-Wilk法), 若符合正態(tài)分布, 計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示, 采用t檢驗；若不符合正態(tài)分布, 計量資料以M(P25, P75)表示, 采用非參數(shù)檢驗(Mann-Whitney U檢驗), CK18-M65、CK18-M30不符合正態(tài)分布, 取10的對數(shù)來分析, 計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗和Fisher精確概率法；相關(guān)性檢驗采用Spearman等級相關(guān)分析法, P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 脂肪肝組與正常對照組各指標比較 兩組CK18-M65對數(shù)、CK18-M30對數(shù)、CAP、LSM、BMI、ALT、AST、TCH、UA、GLU、GGT比較, 差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。兩組年齡、性別、TBIL、ALB比較, 差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 21例NAFLD患者中ALT正常組與ALT升高組各指標比較 21例NAFLD患者中, ALT升高的患者作為升高組,ALT正常的患者作為ALT正常組。兩組血清CK18-M30、ALT、AST、GGT比較, 差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。兩組年齡、性別、BMI、CAP、LSM、CK18-M65對數(shù)、TBIL、ALB、TCH、UA、GLU比較, 差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

表1 NAFLD患者與健康人各指標比較(n, ±s)

表1 NAFLD患者與健康人各指標比較(n, ±s)

注：與正常對照組比較, aP＜0.05, bP＞0.05

指標 脂肪肝組(n=21) 正常對照組(n=23) t/χ2/u P性別 (男 /女 ) 15/6b 13/10 1.054 0.305年齡(歲) 40.05±16.80b 41.70±7.10 0.417 0.669 BMI(kg/m2) 30.96±5.38a 21.47±1.59 8.089 0.000 CAP(dB/m) 331.97±29.82a 202.96±33.41 13.462 0.000 CK18-M65對數(shù)(ng/L) 2.82±0.39a 2.31±0.26 5.146 0.000 CK18-M30對數(shù)(ng/L) 2.21±0.53a 1.70±0.54 3.157 0.003 TBIL(μmol/L) 13.60±6.08b 13.05±5.73 0.309 0.760 ALB(g/L) 43.93±3.75b 42.48±2.01 1.618 0.113 TCH(mmol/L) 5.01±0.63a 4.50±0.91 2.177 0.035 UA(μmol/L) 450.43±136.71a 369.30±91.16 2.335 0.024 GLU(mmol/L) 5.76±1.66a 4.78±0.39 2.752 0.009 LSM(kPa) (9.6, 15.4)a (3.4, 5.4) 15.0 0.000 ALT(U/L) (30, 101)a (11, 29) 48.5 0.000 AST(U/L) (22, 47)a (16, 26) 94.5 0.001 GGT(U/L) (31, 100)a (20, 37) 116.5 0.003

表2 21例NAFLD患者中ALT正常組與ALT升高組各指標比較(n, ±s)

表2 21例NAFLD患者中ALT正常組與ALT升高組各指標比較(n, ±s)

注：與ALT升高組比較, aP＜0.05, bP＞0.05

指標 ALT正常組(n=9) ALT升高組(n=12) t/χ2/u P性別 (男 /女 ) 5/4b 11/1 3.697 0.055年齡(歲) 47.00±14.53b 34.83±17.04 1.297 0.210 BMI(kg/m2) 28.51±3.93b 32.80±5.73 1.926 0.069 CAP(dB/m) 322.93±36.19b 338.75±23.39 1.217 0.238 CK18-M65對數(shù)(ng/L) 2.73±0.42b 2.89±0.36 0.939 0.360 CK18-M30對數(shù)(ng/L) 1.88±0.54a 2.45±0.38 2.845 0.010 TBIL(μmol/L) 14.44±5.64b 12.96±6.56 0.542 0.594 ALB(g/L) 44.27±3.94b 43.69±3.76 0.343 0.736 TCH(mmol/L) 4.70±0.93b 5.40±0.93 1.707 0.104 UA(μmol/L) 392.56±136.89b 493.83±124.73 1.767 0.093 GLU(mmol/L) 5.29±0.99b 6.11±1.99 1.131 0.272 LSM(kPa) (8.4, 15.0)b (9.6, 17.5) 49.000 0.754 ALT(U/L) (25, 401)a (64, 186) 0.000 0.000 AST(U/L) (17, 32)a (34, 70) 15.500 0.004 GGT(U/L) (18, 53)a (42, 115) 17.000 0.007

2.3 ALT正常的脂肪肝組與正常對照組CK18、LSM、CAP的比較 兩組CK18-M65對數(shù)、CAP、LSM比較, 差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。兩組CK18-M30對數(shù)比較, 差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 ALT正常脂肪肝組與正常對照組CK18、LSM、CAP比較( ±s)

表3 ALT正常脂肪肝組與正常對照組CK18、LSM、CAP比較( ±s)

注：與正常對照組比較, aP＜0.05, bP＞0.05

指標 ALT正常脂肪肝組(n=9) 正常對照組(n=23) t P LSM(kPa) 12.60±4.44a 4.36±1.01 8.667 0.000 CAP(dB/m) 322.93±36.20a 202.96±33.41 11.433 0.000 CK18-M65對數(shù)(ng/L) 2.73±0.42a 2.31±0.26 4.027 0.000 CK18-M30對數(shù)(ng/L) 1.88±0.54b 1.70±0.54 1.104 0.276

2.4 CK18-M65、CK18-30與LSM、CAP的相關(guān)性比較 所有研究對象的CK18-M65對數(shù)與CAP(r=0.533, P=0.000＜0.05)、LSM(r=0.441, P=0.003＜0.05)具有相關(guān)性 , CK18-M30對數(shù)與CAP(r=0.302, P=0.056＞0.05)、LSM(r=0.255, P=0.095＞0.05)無 相關(guān)性。

3 討論

CK18是構(gòu)成肝細胞中間絲蛋白的主要成分之一, 其主要功能是維持肝細胞正常結(jié)構(gòu), 保護其免受機械和非機械的損傷。當肝細胞凋亡發(fā)生時, 蛋白酶被活化并開始裂解細胞內(nèi)的不同底物, 包括CK18。目前, 相關(guān)研究認為肝細胞凋亡在NAFLD進展過程中具有重要作用, 肝細胞凋亡的程度與NASH炎癥分級及纖維化分期呈顯著正相關(guān)［3］。Wieckowska等［4］發(fā)現(xiàn)NAFLD患者血清CK18水平明顯升高, 且CK18水平與肝纖維化分期呈正相關(guān)。而且研究發(fā)現(xiàn)在肥胖患者以及兒童中, 可依據(jù)CK18水平診斷NASH［5］。Feldstein等［6］在一項CK18診斷NASH價值的多中心驗證性研究中, 證明M65和M30可作為預(yù)測NASH的獨立危險因素。我國學者研究漢族和維吾爾族NASH與CK18片段的相關(guān)性, 結(jié)果CK18-M30和CK18-M65在健康人、單純性脂肪肝和NASH患者血清中的水平依次升高［7,8］, 提示CK18片段可用于NASH的篩查。本研究結(jié)果也顯示, 脂肪肝組血清CK18-M65、CK18-M30水平顯著高于正常對照組, 差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。因本研究病理組樣本量較少, 尤其是單純性脂肪肝的缺乏, 未能進一步分析CK18-M65、CK18-M30與不同肝組織病理學變化的相關(guān)性。基于瞬時彈性B超是目前無創(chuàng)評估肝內(nèi)脂肪病變程度及肝纖維化程度的一種很好的方法, 本研究中, 所有研究對象的CK18-M65對數(shù)與CAP(r=0.533, P=0.000＜0.05)、LSM(r=0.441, P=0.003＜0.05) 具有相關(guān)性 , CK18-M30 對數(shù)與 CAP(r=0.302, P=0.056＞0.05)、LSM(r=0.255, P=0.095＞0.05)無相關(guān)性。證明CK18-M65可以反映肝內(nèi)脂肪病變程度及纖維化程度。同時, 本研究還發(fā)現(xiàn)ALT正常的脂肪肝組與正常對照組CK18-M65對數(shù)、CAP、LSM比較, 差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明在ALT正常的NAFLD中CK18-M65也能顯示肝臟損傷, 因此CK18-M65比ALT更能反映NAFLD患者的肝臟損傷。而且有研究表明約30%NASH患者ALT水平是正常的。這結(jié)果也與本研究結(jié)果一致。

綜上所述, 血清CK18-M65、CK18-M30水平在診斷NAFLD中具有較高的臨床價值, 為CK18-M65、CK18-M30無創(chuàng)診斷NAFLD尤其是NASH提供了依據(jù)。但由于病理樣本量的局限, 還需在接下來的臨床工作中進行更大樣本量的研究。