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(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,蛋品加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,湖北武漢 430070)

禽蛋是人們獲取營(yíng)養(yǎng)的重要來(lái)源之一,其中富含多種多樣的功能性蛋白。卵黃高磷蛋白(posvitin,PV)就是從禽蛋中提取的磷酸化程度最高的糖蛋白,它占禽蛋總蛋白的7%,含有的磷元素卻高達(dá)10%[1-3]。據(jù)報(bào)道,PV中絲氨酸占所有氨基酸的30%～50%,其磷酸化程度高達(dá)90%[4-6]。這種獨(dú)特的高磷酸化結(jié)構(gòu)使該蛋白在雞胚的骨骼發(fā)育中發(fā)揮了重要作用[7]。體外研究表明，PV還具有很強(qiáng)的金屬離子結(jié)合能力[8]和抗氧化活性[9]等功能。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)PV的研究主要集中在卵黃高磷蛋白乳化性及抗氧化活性、酶解多肽的提取[10]多肽對(duì)金屬離子的結(jié)合[11]等方面。實(shí)驗(yàn)室前期一系列研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),PV具有調(diào)控、誘導(dǎo)Ca2+體外礦化的功能,為PV作為一種骨骼發(fā)育營(yíng)養(yǎng)助劑的高值化應(yīng)用提供了新方向[12]。目前,關(guān)于卵黃高磷蛋白對(duì)成骨細(xì)胞的增殖分化的影響的報(bào)道多集中于細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化[13]。而以生物大分子作載體,研究卵黃高磷蛋白對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化還處于起步階段。

近年來(lái),由于大眾環(huán)保和安全意識(shí)的提升,研究者們將更多的目光集中在生物高分子材料上,利用它們安全、無(wú)毒、易降解的性質(zhì)做成各種復(fù)合膜應(yīng)用于食品包裝和醫(yī)學(xué)、生物等方面[14],比如經(jīng)過(guò)脫乙酰過(guò)程加工后的甲殼素產(chǎn)物──殼聚糖(Chitosan,CS)。殼聚糖是由β-(1,4)-2-氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖構(gòu)成線性,而且是自然界中目前發(fā)現(xiàn)的唯一堿性多糖[15-18]。CS本身是一種弱陽(yáng)離子絮凝劑,因此常用作食品加工中的果汁澄清劑、糖汁絮凝劑[19];此外,CS還可以作為膳食纖維應(yīng)用于食品添加劑中調(diào)節(jié)人體免疫[20]。CS有很強(qiáng)的成膜能力且安全無(wú)毒,因此殼聚糖在食品包裝方面應(yīng)用普遍[21]。據(jù)研究報(bào)道,神經(jīng)干細(xì)胞在CS膜上經(jīng)過(guò)短期培養(yǎng),其貼附效果比在明膠和PLGA膜上更好[22]。表明CS作為新型負(fù)載基質(zhì),在細(xì)胞水平上也表現(xiàn)出很好的生物相容性。

本次研究擬制備氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)復(fù)合CS膜,以提高CS膜的抗水溶性和負(fù)載量。通過(guò)檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化,探討MC3T3-E1細(xì)胞在該復(fù)合膜上的生理活動(dòng),從而研究不同濃度PV對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的影響。以期為后續(xù)為進(jìn)一步發(fā)展PV成為一種促進(jìn)人體骨骼發(fā)育的新型材料和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮雞蛋 武漢九峰山養(yǎng)雞場(chǎng);小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14(MC3T3-E1) 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);胎牛血清、0.25%胰酶EDTA 澳洲GIBCO公司;α-MEM培養(yǎng)基 美國(guó)HyClone公司;抗壞血酸 美國(guó)SIGMA公司;β-甘油磷酸鈉 阿拉丁公司;CCK-8試劑盒、Annexin V/PI試劑盒 北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司;細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒 南京凱基生物；1-(3-甲基氨基醛)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-N-羥基琥珀酰亞胺(NHs) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HERAcell 1501二氧化碳培養(yǎng)箱 德國(guó)Thermo Scientific 公司;IX71熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司;iMark酶標(biāo)儀 聯(lián)想生物科技有限公司;FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司;TDL-50B臺(tái)式低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司;Option S7超純水系統(tǒng) ELGA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 卵黃高磷蛋白的分離純化 參照張曉維[12]的方法提取卵黃高磷蛋白。用分蛋器分離雞蛋清和蛋黃,隨后將蛋黃放在濾紙上,翻滾來(lái)去掉多余的系帶和蛋清,用竹簽刺破蛋黃膜,用冰水浴中的燒杯將流出的蛋黃液收集起來(lái)。加入與蛋黃液同等質(zhì)量的蒸餾水混合,用磁力攪拌器攪拌1 h后,再用12000×g離心力離心10 min,隨后收集下層沉淀。再然后用同等質(zhì)量的0.17 mol/L的NaCl溶液與下層沉淀混合攪拌1 h再在12000×g下離心10 min,這樣使蛋黃顆粒(下層沉淀)與蛋黃漿質(zhì)(上清)分離,收集目標(biāo)物蛋黃顆粒沉淀。用10倍質(zhì)量體積比(g/mL)的1.74 mol/L NaCl溶液和蛋黃顆粒沉淀攪拌混勻,再將溶液的pH調(diào)至4.0,加入聚乙二醇(PEG 6000)使其最終的質(zhì)量比達(dá)到3%,攪拌1 h后1200×g下離心10 min獲得上清液。上清液經(jīng)過(guò)8000～14000 kDa的透析袋透析后，再次12000×g下離心10 min,收集上清液進(jìn)行冷凍干燥,即可獲得粗提卵黃高磷蛋白。粗提卵黃高磷蛋白經(jīng)過(guò)弱陰離子交換柱得到不含二或三價(jià)金屬離子的卵黃高磷蛋白[12]。對(duì)層析后的蛋白透析后冷凍干燥即得到不含多價(jià)金屬離子和鹽的卵黃高磷蛋白。

1.2.2 卵黃高磷蛋白的純度鑒定 本研究采用的是SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒進(jìn)行。選用12%濃度的分離膠和5%濃度的濃縮膠。固體樣品用蒸餾水溶解后配制為2 mg/mL的溶液,從中取40 μL蛋白樣液,與10 μL的5×蛋白上樣緩沖液混勻,水浴煮沸4 min,上樣量為10 μL。分離膠電壓為120 V,濃縮膠電壓為80 V。預(yù)染色蛋白質(zhì)Marker分子量范圍為10～170 kDa。電泳完成后,電泳凝膠先在固定液中固定40 min;然后轉(zhuǎn)移至磷蛋白染色液1中,在45 ℃水浴搖床中染色40 min;接著轉(zhuǎn)移至磷蛋白染色液2中,在相同溫度下繼續(xù)染色40 min。最后將凝膠浸泡在脫色液中進(jìn)行脫色,每隔一段時(shí)間更換脫色液至背景顏色變?yōu)闊o(wú)色為止。最后用凝膠成像儀拍攝電泳結(jié)果。

1.2.3 MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)及CS和GO/CS膜的制備 迅速解凍凍存的MC3T3-E1細(xì)胞,隨后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中在1200×g下離心2 min后倒上清,再加入適量培養(yǎng)基小心吹打均勻。隨后將細(xì)胞懸濁液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板上,補(bǔ)充培養(yǎng)液保證每孔溶液約3.5 mL左右進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量鋪滿培養(yǎng)板面積的85%～95%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)。小鼠成骨細(xì)胞傳代時(shí),先用適量滅菌Hanks緩沖液清洗細(xì)胞2～3次,隨后用1 mL胰酶消化80 s左右,隨后加入2×胰酶溶液體積的細(xì)胞培養(yǎng)液,輕輕吹打幾下后將細(xì)胞混合溶液轉(zhuǎn)移到離心管中,1200×g下離心2 min。倒上清,加入新的培養(yǎng)液后小心吹打均勻,隨后分裝到新的細(xì)胞培養(yǎng)板上。MC3T3-E1細(xì)胞用α-MEM完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 U/mg青霉素和100 μg/mL鏈霉素)在37 ℃,5% CO2和濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

制備CS及GO/CS膜:取1 g CS溶解于100 mL濃度為2%(v/v)的醋酸溶液中,在50 ℃下攪拌2 h溶解,室溫下靜置除去溶液中的氣泡。取適量的1 mg/mL的GO溶液,分別加入EDC和NHS使之最后的濃度為0.03、0.06 mol/L用以活化羧基,攪拌混勻后用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=7.0。將GO溶液和CS溶液混合使二者的質(zhì)量比分別為0∶100、0.5∶100、1∶100和2∶100,即CS膜、0.5% GO/CS膜、1% GO/CS膜和2% GO/CS膜。隨后溶液超聲4 h后備用。將上述溶液分別倒入6孔(1 mL)或是96孔(100 μL)細(xì)胞培養(yǎng)板中,50 ℃下晾干。之后用1 mol/L NaOH溶液浸泡CS膜15 min,之后用超純水沖洗3次,再次烘干。使用之前用紫外滅菌30 min。

1.2.4 CS及其復(fù)合膜對(duì)細(xì)胞活性影響 本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞活性的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1細(xì)胞1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸濁液150 μL放入含有膜的96孔培養(yǎng)板中,放置在培養(yǎng)箱中培育24 h,培養(yǎng)箱的環(huán)境為37 ℃,5% CO2,濕度90%。24 h后棄掉原培養(yǎng)液,再向每孔加入135 μLα-MEM完全培養(yǎng)液+15 μL CCK-8溶液在37 ℃下培育2 h,之后在450 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。每組設(shè)置6組重復(fù),此試驗(yàn)重復(fù)3次。空白組為不加細(xì)胞，但是加入135 μL培養(yǎng)液+15 μL CCK-8。

1.2.5 CS及其復(fù)合膜對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 采用Annexin V/PI試劑盒檢測(cè)。細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于上述制備的6孔板上,細(xì)胞培養(yǎng)板分為空白組、CS膜、0.5% GO/CS膜、1% GO/CS膜和2% GO/CS膜5組。細(xì)胞培育24 h后,用含EDTA的胰酶消化后1200×g離心5 min去上清,用PBS緩沖液重懸,離心去上清,再用PBS緩沖液重懸離心去上清,并且保證每個(gè)試驗(yàn)樣品的細(xì)胞數(shù)不少于1×106個(gè)。然后加入500 μL的細(xì)胞上樣液,5 μL的膜聯(lián)蛋白-V(Annexin V)和10 μL的碘化丙啶(PI),混合均勻。室溫避光反應(yīng)15 min,為保證實(shí)驗(yàn)效果樣品要在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 CS及其復(fù)合膜對(duì)細(xì)胞周期的影響 具體過(guò)程:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種在空白組和CS薄膜的6孔培養(yǎng)板上,細(xì)胞的濃度為2×106個(gè)/孔;培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞總數(shù)不少于1×106個(gè)/孔,用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞,終止消化后收集細(xì)胞,在1200×g離心5 min后去上清,PBS重懸潤(rùn)洗細(xì)胞沉淀1次;1000×g離心5 min,去上清,100 μL PBS重懸細(xì)胞,將700 μL預(yù)冷的80%乙醇緩慢加入,使乙醇終濃度為70%;4 ℃固定4 h以上;1000×g離心5 min,預(yù)冷PBS潤(rùn)洗2次,隨后加入100 μL RNase(50 μg/mL),37 ℃水浴30 min;加入400 μL PI,4 ℃避光染色30 min;流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI熒光強(qiáng)度。用Cotfit軟件分析G1期、S期、G2期細(xì)胞數(shù),計(jì)算細(xì)胞各周期所占的比例。

增殖指數(shù)PI(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2M)×100

1.2.7 卵黃高磷蛋白對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響 為研究不同濃度卵黃高磷蛋白對(duì)細(xì)胞影響和磷蛋白與CS膜共同作用細(xì)胞的影響,實(shí)驗(yàn)分為兩大組:空白組和CS膜組。在每組中,細(xì)胞α-MEM培養(yǎng)液中分別加入0、100、200和500 μg/mL PV進(jìn)行研究。采用CCK-8試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1細(xì)胞1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸濁液150 μL接種到底部有CS膜和沒CS膜的96孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后,加入含有不同PV濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,隨后盡量吸走上清液,并加入150 μL含有10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基。培育2 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。

1.2.8 卵黃高磷蛋白對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)分為兩大組:空白組和CS膜組。在每組中,細(xì)胞α-MEM培養(yǎng)液中分別加入0、100、200和500 μg/mL PV進(jìn)行研究。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1細(xì)胞1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸濁液1 mL接種到底部有CS膜和沒有CS膜的6孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后,加入含有不同PV濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。后續(xù)過(guò)程同1.2.5。

1.3 數(shù)據(jù)處理

細(xì)胞增殖結(jié)果均用Origin 8.0作圖,用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析,用Flowjo軟件對(duì)流式細(xì)胞儀結(jié)果進(jìn)行分析及作圖,用Cotfit軟件分析細(xì)胞周期數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE凝膠電泳分析

卵黃高磷蛋白是一種高度磷酸化的糖蛋白,目前來(lái)自雞蛋的卵黃高磷蛋白主要分為α-PV和β-PV。其中,α-PV含有3～4個(gè)亞基,分子量為35～40 kDa,而β-PV含有4～5個(gè)亞基,主要分子量為45 kDa。圖1表明,卵黃高磷蛋白主要條帶在35 kDa左右,制備的PV主要條帶和Sigma標(biāo)品的條帶一致。因此,可以用此蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 Sigma標(biāo)準(zhǔn)品與提取的卵黃高磷蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE patterns of purified phosvitin from egg yolk compared with Sigma standard phosvitin

2.2 CS及其復(fù)合膜對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響

CCK-8試劑盒是一種間接測(cè)量細(xì)胞活性的方法。從圖2可見,與空白對(duì)照組(組織培養(yǎng)聚苯乙烯板)相比,CS膜能夠極顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性(p<0.01),提高了31.92%。GO/CS膜則都降低了細(xì)胞活性,GO含量越多,細(xì)胞活性下降越明顯,GO含量為2%時(shí),細(xì)胞活性下降了83.9%。這說(shuō)明GO對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖有抑制作用,并且呈現(xiàn)劑量依賴性。之前有研究表明，CS具有良好的生物相容性,對(duì)SD胎鼠顱骨成骨細(xì)胞[23]與間充質(zhì)干細(xì)胞[24]無(wú)毒性作用。有學(xué)者證實(shí)了碳基納米材料對(duì)不同的細(xì)胞有不同的毒害作用[25],此結(jié)果同樣說(shuō)明了GO對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞有毒害作用。

圖2 CS及GO/CS膜對(duì)細(xì)胞活性影響Fig.2 Effects of chitosan and graphene oxide/chitosan membrane on cell viability注:不同小寫字母表示差異極顯著(p<0.01);圖4、圖6、圖7、圖9同。

2.3 CS膜及GO/CS膜對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞在CS及GO/CS復(fù)合膜上培育24 h后細(xì)胞狀態(tài)的具體情況如圖3。對(duì)圖3中正在凋亡和已經(jīng)凋亡的細(xì)胞占比總結(jié)得圖4,分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):CS膜組的凋亡率相比空白組顯著下降了45.78%;但是隨著GO的加入,MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),GO含量到2%時(shí),凋亡率到達(dá)了17.64%。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明，CS能夠降低細(xì)胞的凋亡過(guò)程,而GO卻對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,加劇了細(xì)胞凋亡。此結(jié)果與上面的細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

圖3 CS及GO/CS膜對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡分布影響Fig.3 Effect of chitosan and its graphene oxide composite membrane on the apoptosis of MC3T3-E1 cells

圖4 CS及GO/CS膜對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞總凋亡的統(tǒng)計(jì)Fig.4 Statistics of total apoptosis of MC3T3-E1 cells by chitosan and graphene oxide/chitosan membrane

2.4 CS膜對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期是說(shuō)從一次細(xì)胞分裂結(jié)束開始到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束為止的過(guò)程。一般來(lái)說(shuō)細(xì)胞周期分為:G0期、G1期、S期、G2期和M期。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)后的細(xì)胞各個(gè)周期的比例,如圖5。由于檢測(cè)過(guò)程中G0期和G1期的DNA數(shù)量相同,流式細(xì)胞儀不能區(qū)分兩者各自的檢測(cè)值,因此顯示為一個(gè)指標(biāo),標(biāo)記為G0/G1。同樣,G2和M也整合成一個(gè)指標(biāo),標(biāo)記為G2/M。在細(xì)胞整個(gè)分裂過(guò)程中,S期是指從DNA合成開始到結(jié)束的過(guò)程,在細(xì)胞分裂過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。如圖6所示,空白組的細(xì)胞周期分布為:G0/G1期為69.6%,S期為21.42%,G2/M期為8.98%;在CS膜上培育的細(xì)胞周期分布則是:G0/G1期為60.84%,S期為30.63%,G2/M期為8.53%。相比于空白組,CS膜組的G0/G1期細(xì)胞比例下降12.59%,S期細(xì)胞比例上升了43.00%。此結(jié)果說(shuō)明,CS膜對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用,這與前面細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。

圖5 CS膜上MC3T3-E1各個(gè)細(xì)胞周期分布Fig.5 Distribution of the cell cycle of MC3T3-E1 on the chitosan membrane

圖6 CS對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞對(duì)各個(gè)細(xì)胞周期所占的百分比的影響Fig.6 Effect of chitosan on the percentage of MC3T3-E1 cells in each cell cycle

2.5 卵黃高磷蛋白對(duì)培養(yǎng)在CS膜上MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

卵黃高磷蛋白是一種高度磷酸化的糖蛋白,與金屬離子有很強(qiáng)的結(jié)合能力。據(jù)報(bào)道,體外培養(yǎng)的情況下,卵黃高磷蛋白對(duì)人牙髓細(xì)胞在10、100 ng/mL濃度下均能促進(jìn)該細(xì)胞增殖,而在1 μg/mL的濃度下則產(chǎn)生抑制作用[26]。由于相同濃度的卵黃高磷蛋白對(duì)不同的細(xì)胞的影響效果不同,此次實(shí)驗(yàn)選擇的濃度參考本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果[27]。根據(jù)圖7可以看出,卵黃高磷蛋白對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。殼聚糖膜上，低濃度卵黃高磷蛋白(100 μg/mL)對(duì)細(xì)胞增殖促進(jìn)作用最明顯，為181.59%，上升81.59%；當(dāng)?shù)鞍诐舛鹊竭_(dá)200 μg/mL時(shí)，和100 μg/mL蛋白濃度相比促進(jìn)作用下降，但是與空白組(0 μg/mL蛋白濃度)相比，仍然顯示出顯著促進(jìn)作用(p<0.05)；而蛋白濃度達(dá)到500 μg/mL則出現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞增殖的抑制現(xiàn)象，細(xì)胞增殖僅為95.53%，下降了4.47%?？瞻捉M蛋白濃為500 μg/mL細(xì)胞增殖率最低，為61.36%。這說(shuō)明卵黃高磷蛋白促進(jìn)該細(xì)胞增殖的最佳濃度在100 μg/mL附近。綜合Liu等[28]的研究,推測(cè)卵黃高磷蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖可能是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分裂前期S期的細(xì)胞比例實(shí)現(xiàn)的。而CS對(duì)不含PV的組促進(jìn)作用明顯,在低、中濃度蛋白的情況下促進(jìn)作用不明顯,在高濃度蛋白下則產(chǎn)生了抑制的現(xiàn)象。

圖7 不同PV濃度在不同基質(zhì)上對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.7 Effects of different concentrations of PV on cell proliferation in different substrates

2.6 卵黃高磷蛋白對(duì)培養(yǎng)在CS膜上MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響

圖8是卵黃高磷蛋白作用細(xì)胞24 h后經(jīng)過(guò)Flowjo軟件分析處理后的處在不同細(xì)胞時(shí)期的圖像。分析圖9發(fā)現(xiàn),卵黃高磷蛋白對(duì)空白組和CS膜組產(chǎn)生的趨勢(shì)是一致的。相比與不添加卵黃高磷蛋白組,添加了100、200 μg/mL卵黃高磷蛋白會(huì)顯著抑制細(xì)胞凋亡(p<0.05);而當(dāng)?shù)鞍诐舛冗_(dá)到500 μg/mL時(shí),細(xì)胞凋亡所占比例顯著增加(p<0.05)。

圖8 CS膜上卵黃高磷蛋白對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響Fig.8 Eeffect of phosvitin on the apoptosis of MC3T3-E1 cells in chitosan membrane

圖9 CS膜上卵黃高磷蛋白對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞總凋亡的影響統(tǒng)計(jì)Fig.9 Statistics of effect of phosvition on total apoptosis of MC3T3-E1 cells on chitosan membrane

3 結(jié)論

殼聚糖能通過(guò)促使MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)入分裂周期提高增殖活性,氧化石墨烯對(duì)細(xì)胞有毒性作用,呈現(xiàn)劑量依賴。因此,殼聚糖適合做MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì),氧化石墨烯則不適于該細(xì)胞后續(xù)研究。在殼聚糖基質(zhì)上,卵黃高磷蛋白在100 μg/mL濃度時(shí)促進(jìn)增殖和抑制凋亡的效果最明顯,在500 μg/mL則開始出現(xiàn)抑制增殖和促進(jìn)凋亡的效果。這可能與卵黃高磷蛋白的磷酸化有關(guān)。該結(jié)果為后續(xù)研究二者共同對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞后影響,為開發(fā)卵黃高磷蛋白的深層利用價(jià)值提供依據(jù)。