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(廣西食品藥品檢驗(yàn)所,廣西南寧 530021)

涼茶是我國(guó)南方流行的一類(lèi)飲料,是嶺南人民根據(jù)本地的氣候和水土特性,在長(zhǎng)期預(yù)防疾病與保健過(guò)程中以中醫(yī)養(yǎng)生理論為指導(dǎo),以多種藥食同源的中草藥為基礎(chǔ),研制總結(jié)而來(lái)[1-3]。近年來(lái),不法分子受利益驅(qū)使,向涼茶中非法添加化學(xué)藥物,以提高其功效。由于化學(xué)藥物有一定的副作用,大量或不正確的使用有可能導(dǎo)致嚴(yán)重后果,因此有必要加強(qiáng)對(duì)涼茶中非法添加化學(xué)藥物的分析檢測(cè)。國(guó)家對(duì)自制出售的涼茶尚未出臺(tái)強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn),衛(wèi)生及食藥監(jiān)管部門(mén)對(duì)涼茶監(jiān)管尚屬空白,建立簡(jiǎn)便、靈敏、快捷的方法來(lái)檢查產(chǎn)品中是否非法添加化學(xué)藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前,涼茶中非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)已有報(bào)道,主要檢測(cè)對(duì)象為解熱鎮(zhèn)痛類(lèi)及抗菌藥類(lèi)化學(xué)藥物[4-6]。本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的QuEChERS方法[7-13]提取、凈化樣品,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè),建立宣稱止咳平喘功效的涼茶中非法添加的10種化學(xué)藥物的快速檢測(cè)方法,以期為涼茶中非法添加藥物的檢測(cè)方法作出補(bǔ)充,為相關(guān)監(jiān)管部門(mén)日常監(jiān)督提供科學(xué)、客觀的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Agilent 6460型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜,配Agilent1290型液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司;Agilent SB-C18柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm) 美國(guó)安捷倫公司。

8批實(shí)驗(yàn)樣品 購(gòu)于南寧,均宣稱有止咳、化痰、平喘功效;醋酸潑尼松(Prednisone acetate)(純度99.7%)、氫化可的松(Hydrocortisone)(純度100.0%)、地塞米松(dexamethasone)(純度99.8%)、枸櫞酸噴托維林(pentoxyverine citrate)(純度98.7%)、磷酸苯丙哌林(Benproperine Phosphate)(純度99.8%)、鹽酸溴己新(Bromhexine Hydrochloride)(純度99.9%)、鹽酸氨溴索(Ambmxol Hydochloride)(純度99.9%);醋酸可的松(cortisone acetate)(純度99.1%)、倍他米松(betamethasone)(純度99.3%);布地奈德(budesonide)(純度99.4%) 以上對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定研究院;甲醇、乙腈、甲酸 均為色譜純,美國(guó)Fisher公司;乙酸銨、氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水 超純水,實(shí)驗(yàn)室自制;C18吸附劑、乙二胺基-N-丙基吸附劑(PSA)、石墨化碳黑(GCB)吸附劑、氨丙基(NH2)吸附劑 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,分別置于25 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配成濃度為400 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,在-18 ℃儲(chǔ)存。使用時(shí)根據(jù)需要吸取適量的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合,用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于-18 ℃下儲(chǔ)存。

1.2.2 樣品處理 準(zhǔn)確移取樣品5.00 mL(精確至0.01 mL)于15 mL聚丙烯塑料離心管中,加入5.00 mL乙腈,渦旋1 min后加入0.5 g無(wú)水MgSO4和2.0 g NaCl,渦旋混勻,5000 r/min離心5 min,收集上清液于另一15 mL離心管中(已加入100 mg C18),渦旋2 min,5000 r/min離心5 min,取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,濾液供LC-MS/MS測(cè)定。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:Agilent SB-C18 Column(100 mm×4.6 mm,2.7 μm);流動(dòng)相:A為乙腈,B為10 mmol/L醋酸銨溶液(含0.1%甲酸),梯度洗脫程序:0～5 min,30% A;5～19 min,30% A→60% A;19～20 min,60% A→30% A;20～25 min,30% A。流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;柱溫:35 ℃。

1.2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI);正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);毛細(xì)管電壓:3500 V;干燥氣溫度(TEM):350 ℃;干燥氣流速:5 L/min;鞘流氣溫度:350 ℃;鞘流氣流速:10 L/min;霧化氣壓力:40 psi;質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 10種化學(xué)藥物質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Parameter of mass spectra of 10 chemical drugs

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)采集數(shù)據(jù)、命名及積分,Microsoft Excel 2010(美國(guó)微軟公司)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

液相色譜儀接兩通,色譜條件為50%甲醇溶液作為流動(dòng)相,流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣量為1 μL,采用各組分的儲(chǔ)備溶液以單針進(jìn)樣的方式,分別在正、負(fù)離子模式下,對(duì)各待測(cè)化合物進(jìn)行全掃描,以選擇合適的電離方式和準(zhǔn)分子離子。各待測(cè)化合物在正電離模式下得到各自的準(zhǔn)分子離子[M+H]+,再對(duì)各準(zhǔn)分子離子產(chǎn)生的子離子及子離子的碎裂電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化選擇,以兩個(gè)相對(duì)豐度最高的特征離子作為定性離子,并以其中相對(duì)豐度較高的子離子作為定量離子,最終確定的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)中考察了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.01 mol/L乙酸銨溶液-乙腈、0.1%甲酸溶液-甲醇和0.01 mol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)-乙腈等流動(dòng)相體系對(duì)10種化學(xué)藥物的色譜峰形、分離度以及信號(hào)強(qiáng)度的影響。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),水-乙腈、0.01 mol/L乙酸銨溶液-乙腈系統(tǒng)中,大部分化合物峰形拖尾,且信號(hào)強(qiáng)度低;含有甲醇體系的流動(dòng)相會(huì)促使大部分化合物色譜峰拖尾、峰形鈍化;0.1%甲酸水溶液-乙腈系統(tǒng)中鹽酸溴己新、枸櫞酸噴托維林、磷酸苯丙哌林的峰形分叉。選擇0.01 mol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)-乙腈作為流動(dòng)相,10種化學(xué)藥物的分離效果更好、信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)更高,因此選擇該系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

梯度洗脫條件的優(yōu)化:經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn),改變不同時(shí)間段流動(dòng)相中有機(jī)相和水相的比例,最終確定了最佳梯度洗脫程序:0～5 min,30%乙腈;5～19 min,30%乙腈→60% 乙腈;18～19 min,60% 乙腈→30% 乙腈;0～5 min,30%乙腈。10種化學(xué)藥物的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 10種化學(xué)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05 mg/L)的LC-MS/MS色譜圖Fig.1 LC-MS/MS chromatograms of a mixed standard solution of the 10 chemical drugs(0.05 mg/L)注:1:氨溴索;2:氫化可的松;3:地塞米松;4:倍他米松; 5:鹽酸溴己新;6:枸櫞酸噴托維林;7:醋酸潑尼松; 8:醋酸可的松;9:磷酸苯丙哌林;10:布地奈德。

2.3 提取溶劑的選擇

涼茶一般為中草藥的水溶液提取物,含有大量親水性的成分,如無(wú)機(jī)鹽、糖類(lèi)、鞣質(zhì)、氨基酸、生物堿鹽及苷類(lèi)等,基質(zhì)復(fù)雜,因此需要采用適當(dāng)?shù)奶崛『蛢艋绞綄?duì)樣品進(jìn)行處理,以便盡可能的減少干擾,提高分析靈敏度。本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、丙酮、乙酸乙酯等常用提取溶劑的提取效果,經(jīng)過(guò)觀察發(fā)現(xiàn),乙腈提取液中色素較少,故選用乙腈作為提取溶劑。

2.4 吸附劑種類(lèi)和用量的選擇

QuEChERS方法中,PSA、C18、NH2和GCB是常見(jiàn)的吸附劑。本實(shí)驗(yàn)考察了十八烷基硅烷鍵合硅膠吸附劑(C18)、乙二胺基-N-丙基吸附劑(PSA)、石墨化碳黑(GCB)吸附劑、氨丙基(NH2)吸附劑(加入量均為100 mg)的提取效果,隨著GCB的加入,大部分化合物均無(wú)信號(hào)。PSA與NH2作為吸附劑時(shí)氨溴索、地塞米松與倍他米松的回收率均低于80%,采用C18時(shí),10種化學(xué)藥物的回收率均能達(dá)到80%以上(圖2),因此選擇C18作為吸附劑。

圖2 吸附劑對(duì)10 種化學(xué)藥物回收率的影響Fig.2 Effect of adsorbent on the recoveries of the 10 chemical drugs spiked herbal teas

2.5 除水劑用量的選擇

實(shí)驗(yàn)中加入過(guò)飽和的無(wú)水MgSO4和NaCl可促使有機(jī)相與水相分層,減少共提物,提高目標(biāo)物的提取效率。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)還對(duì)兩者的用量進(jìn)行了優(yōu)化。在固定無(wú)水MgSO4的加入量為0.5 g時(shí),考察了NaCl在1.0～2.5 g的使用范圍內(nèi)的提取效果,結(jié)果當(dāng)NaCl用量在2.0 g時(shí),各化合物的回收率均達(dá)到最大(圖3);確定NaCl用量后,考察了無(wú)水MgSO4在0.5～2.0 g的使用范圍內(nèi)的提取效果,結(jié)果無(wú)水MgSO4使用量對(duì)回收率影響不大(圖4)。因此,本實(shí)驗(yàn)無(wú)水MgSO4和NaCl的最佳加入量分別為0.5、2.0 g。

圖3 氯化鈉用量對(duì)10 種化學(xué)藥物回收率的影響Fig.3 Effect of dosage of NaCl on the recoveries of the 10 chemical drugs spiked herbal teas

圖4 無(wú)水硫酸鎂用量對(duì)10 種化學(xué)藥物回收率的影響Fig.4 Effect of dosage of MgSO4 on the recoveries of the 10 chemical drugs spiked herbal teas

2.6 方法的線性關(guān)系、檢出限、回收率和精密度

取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用甲醇配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定,以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。結(jié)果10種化學(xué)藥物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9984～0.9999。

表2 10種化學(xué)藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)和檢出限Table 2 Linear range,linear equation,correlation and LOD of the 10 chemical drugs

在陰性涼茶樣品中添加不同濃度的待測(cè)物,按本研究建立的方法進(jìn)行檢測(cè),以信噪比S/N=3計(jì)算方法的檢出限,10種化學(xué)藥物的檢出限在0.1～3.0 μg/L之間。

取陰性涼茶樣品,分別添加3個(gè)濃度水平的10種待測(cè)化合物,每個(gè)水平測(cè)定3份平行樣品,考察方法的回收率和精密度。結(jié)果見(jiàn)表3。從中可以看出,各化合物在3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為67.1%～108.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.2%～6.9%。

表3 陰性涼茶樣品中10種化學(xué)藥物的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of the 10 chemical drugs in a blank sample(n=3)

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

從南寧市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的8份涼茶樣品,采用本研究建立的多組分檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果均未檢出上述化學(xué)藥物。

3 結(jié)論

將QuEChERS前處理方法應(yīng)用于涼茶中非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè),通過(guò)對(duì)QuEChERS前處理方法及儀器色譜條件的優(yōu)化,建立了定性、定量測(cè)定涼茶中氨溴索、氫化可的松、地塞米松、倍他米松、鹽酸溴己新、枸櫞酸噴托維林、醋酸潑尼松、醋酸可的松、磷酸苯丙哌林、布地奈德等10種非法添加的止咳平喘類(lèi)化學(xué)藥物的檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高,10種待測(cè)物在各自的濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均不小于0.9984,檢出限為0.1～3.0 μg/L,在三個(gè)不同添加水平下的平均回收率為67.1%～108.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.2%～6.9%。該方法操作簡(jiǎn)單,凈化效果好，靈敏度高,對(duì)涼茶基質(zhì)凈化效果好,可用于涼茶中10種非法添加的止咳平喘類(lèi)化學(xué)藥物的快速篩查和測(cè)定。