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(1.廣州工商學(xué)院物流系,廣東廣州 510000； 2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088； 3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524088； 4.廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524088; 5.泉州師范學(xué)院福建省海洋藻類(lèi)活性物質(zhì)制備與功能開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建泉州 362000)

近年來(lái),隨著人們生活模式的改變,飲食精細(xì)、運(yùn)動(dòng)少、生活及工作的壓力等因素導(dǎo)致高血脂癥患者急劇上升。大量研究[1-2]表明高血脂癥會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化,從而促發(fā)高血壓、冠心病、腦血栓、糖尿病等多種疾病,是心血管疾病的主要誘因。高血脂癥主要表現(xiàn)為血漿或血清中總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白含量(LDL-C)升高和(或)甘油三酯(TG)含量增高,高密度脂蛋白含量(HDL-C)下降。目前,一些藥物可以有效調(diào)節(jié)血脂代謝,降低血脂水平,但存在不同程度的毒副作用,不適合長(zhǎng)期服用。因此,尋找無(wú)毒高效的降血脂天然成分極為必要。

研究表明很多海藻如海帶、龍須菜等均有降血脂的功效[3-6]。隨著對(duì)南海海洋資源的開(kāi)發(fā),資源極為豐富的馬尾藻受到極大的關(guān)注。亨氏馬尾藻(SargassumhenslowianumC.Agardh)作為一種生長(zhǎng)在南海海域的大型經(jīng)濟(jì)褐藻,化學(xué)成分豐富且擁有多種生物活性。研究發(fā)現(xiàn)馬尾藻中多種成分具有降血脂、抗氧化、抗菌等作用[7-10],如諶素華等[11]的研究表明亨氏馬尾巖藻聚糖硫酸酯具有顯著的降血脂功能。由于馬尾藻中含有豐富的有效成分如多糖、多不飽和脂肪酸、多酚、甾醇、類(lèi)胡蘿卜素等等,不同的成分結(jié)構(gòu)和活性特點(diǎn)不同,可能存在協(xié)同或互補(bǔ)作用。亨氏馬尾藻除了含有多糖外,還含有豐富的其他次生產(chǎn)物,目前已有研究對(duì)這些次生產(chǎn)物進(jìn)行了分離和純化及結(jié)構(gòu)表征,但對(duì)這些成分的活性尚未展開(kāi)較為系統(tǒng)的研究。

Triton WR-1339作為一種表面活化劑,注射一定劑量后能夠使小鼠血清TC、TG及LDL-C明顯上升,誘發(fā)急性高血脂癥,該模型具有操作簡(jiǎn)便、藥效明顯快速的特點(diǎn),因此被廣泛應(yīng)用于篩選天然或者合成的降血脂藥物[12-16]。

本研究利用Triton WR-1339誘導(dǎo)建立急性高血脂小鼠模型研究亨氏馬尾藻醇提取物對(duì)動(dòng)物血清及肝臟脂質(zhì)水平的影響,評(píng)價(jià)其體內(nèi)抗氧化作用,探討其降血脂、抗氧化作用和動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)系,為亨氏馬尾藻的活性成分研究和開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亨氏馬尾藻 2016年5月采自廣東湛江硇洲島,洗凈風(fēng)干,粉碎過(guò)60目篩,-20 ℃儲(chǔ)藏備用;SPF級(jí)昆明雄性小鼠,48只,體重(20±2) g,南方醫(yī)科大學(xué)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證編號(hào):SCXK(粵)2013-0034;動(dòng)物飼料 廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;Triton WR-1339 廣州小木蟲(chóng)生物科技有限公司;BCA蛋白測(cè)定試劑盒、總膽固醇檢測(cè)試劑盒、甘油三酯檢測(cè)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇測(cè)試盒、低密度脂蛋白膽固醇測(cè)試盒、總脂酶(LPL)測(cè)試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)試盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)試盒、總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所。

RT-34粉碎機(jī) 榮聰精密科技有限公司;N-1000V-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA公司;UV2550紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;Varioskan Flash全自動(dòng)酶標(biāo)儀、微量移液器 均為美國(guó)Themo公司;CR22G高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司;Alphal-4真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司;7000全自動(dòng)生化分析儀 日本日立。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亨氏馬尾藻粗提物的制備 亨氏馬尾藻粉用95%乙醇按料液比1∶10進(jìn)行室溫浸泡,室溫振蕩提取3次,提取時(shí)間依次為12、24、48 h,減壓抽濾,棄去濾渣,合并濾液,減壓濃縮(濃縮溫度42 ℃,濃縮壓力0 MPa),-52 ℃真空冷凍干燥24 h,得到亨氏馬尾藻提取物,用超純水配制稀釋至所需濃度樣品,進(jìn)行給藥[17]。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理 基礎(chǔ)性飼料喂養(yǎng),室溫(23±2) ℃,濕度40%～70%,12 h光照/黑暗交替。試驗(yàn)前,飼養(yǎng)5 d以適應(yīng)環(huán)境,自由采食,飲水。隨后隨機(jī)[18]分成4組:分別編號(hào)為正常組,高脂模型組,亨氏馬尾藻提取物低、高劑量組,每組12只。按參考文獻(xiàn)[14-15]方法,每天晚上7點(diǎn)進(jìn)行灌胃,亨氏馬尾藻提取物低、高劑量組每天按照250、500 mg/kg分別灌胃亨氏馬尾藻提取物,正常組和高脂模型組給予等體積蒸餾水,灌胃體積均為10 mL/kg,試驗(yàn)期間,各組小鼠自由采食,飲水。連續(xù)給藥12 d,末次給藥前18 h,除正常組尾靜脈注射等體積生理鹽水外,其余各組均以350 mg/kg的劑量尾靜脈注射Triton WR-1339,禁食不禁水。末次給藥1 h后,眼球取血,室溫靜置2 h,3000 r/min離心15 min分離血清,血清放于4 ℃保存,同時(shí)摘取肝臟用生理鹽水洗凈,濾干,稱(chēng)重,于-80 ℃保存,備用。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.2.3.1 體重和肝臟指數(shù) 每隔6 d同一時(shí)間稱(chēng)重一次,記錄小鼠體重的變化。肝臟指數(shù)按照肝臟指數(shù)=肝臟重量/體重×100進(jìn)行計(jì)算。初重:連續(xù)給藥的第1 d小鼠重量。

1.2.3.2 血清血脂的測(cè)定 取血清測(cè)定TC、TG、LDL-C、HDL-C。所有測(cè)定均按照相應(yīng)試劑盒測(cè)試說(shuō)明在全自動(dòng)生化分析儀上完成。按公式AI1=(TC-HDL-C)/HDL-C和AI2=LDL-C/HDL-C計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)[19]。

1.2.3.3 肝組織勻漿液的制備及其蛋白的測(cè)定 稱(chēng)取肝臟組織,按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例,加入9倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下勻漿,2500 r/min離心15 min,棄去沉淀得上清液即得到10%肝組織勻漿液,分裝,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

肝組織勻漿蛋白含量按照BCA法蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.4 肝勻漿脂質(zhì)的測(cè)定 取10%肝組織勻漿液測(cè)定TC、TG、LDL-C、HDL-C。所有測(cè)定均按照相應(yīng)試劑盒測(cè)試說(shuō)明在全自動(dòng)生化分析儀上完成。

1.2.3.5 肝勻漿脂蛋白脂酶(LPL)的測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明以比色法進(jìn)行測(cè)定。定義每毫克組織蛋白每小時(shí)在反應(yīng)系統(tǒng)中所產(chǎn)生的1 μmol的游離脂肪酸為一個(gè)酶活性單位(FFAμmol/mg prot·h)。

1.2.3.6 肝勻漿抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 抗氧化能力(T-AOC)按照試劑盒說(shuō)明以比色法進(jìn)行測(cè)定。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。定義為在37 ℃時(shí),每分鐘每毫克組織蛋白使反應(yīng)體系的吸光度值升高,每增加0.01時(shí),為一個(gè)總抗氧化能力單位。

過(guò)氧化氫酶(CAT)按照試劑盒說(shuō)明以比色法進(jìn)行測(cè)定。定義每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol 的H2O的量為一個(gè)活力單位。

超氧化物歧化酶(SOD)按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。定義每毫克組織蛋白SOD抑制率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD活力單位(U)。

丙二醛按照試劑盒說(shuō)明以TBA法進(jìn)行測(cè)定。

其中,測(cè)定中所需要的肝組織勻漿液組織蛋白含量按照1.2.3.3測(cè)定的結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用JMP10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異性分析,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,p<0.05表示存在顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重變化及肝臟指數(shù)

在實(shí)驗(yàn)期間,各組別小鼠的體重均呈增長(zhǎng)的趨勢(shì),但是各組間小鼠體重?zé)o顯著性差異(表1),說(shuō)明亨氏馬尾藻提取物沒(méi)有明顯影響小鼠的正常生理代謝和生長(zhǎng)。高脂模型與正常對(duì)照組相比,肝臟指數(shù)有顯著差異性,而亨氏馬尾藻提取物低劑量組和高劑量組與正常對(duì)照組相比肝臟指數(shù)均無(wú)顯著差異性(表1),因此,亨氏馬尾藻提取物對(duì)小鼠肝臟的正常代謝影響不顯著,也表明實(shí)驗(yàn)小鼠能夠適應(yīng)此兩種劑量的亨氏馬尾藻提取物給藥處理。

表1 不同組別小鼠試驗(yàn)期間體重的變化以及肝臟指數(shù)Table 1 Effect of S.henslowianum extract on body weight and liver index of mice with hyperlipidemia

2.2 亨氏馬尾藻提取物對(duì)小鼠血清脂質(zhì)水平和動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組相比,高脂模型組血清中TC、LDL-C含量均顯著升高,HDL-C顯著降低,TG含量雖有一定的升高,但并無(wú)顯著性差異,依然可以認(rèn)為T(mén)riton WR-1339誘發(fā)的小鼠急性高脂血癥模型成功(表2)。與高脂模型組相比,亨氏馬尾藻提取物低劑量組小鼠血清TC含量顯著下降。低、高劑量組TG分別下降12.61%和7.14%,低劑量組TG接近正常水平,各組間無(wú)顯著差異。低、高劑量組的HDL-C均高于模型組,但僅高劑量組有顯著差異。低、高劑量組LDL-C水平明顯下降,均顯著低于模型組。

表2 亨氏馬尾藻提取物對(duì)試驗(yàn)小鼠血清脂質(zhì)水平的影響Table 2 Effect of S.henslowianum extract on serum lipid of mice with hyperlipidemia

醫(yī)學(xué)上常用動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)AI1和AI2反應(yīng)動(dòng)脈硬化的嚴(yán)重程度。與正常對(duì)照組相比,高脂模型組的動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)AI1和AI2顯著升高(表3)。亨氏馬尾藻提取物低劑量和高劑量處理組中,與高脂模型組相比AI1和AI2均呈顯著下降趨勢(shì),其中,AI1分別下降了27.01%和33.02%,AI2分別下降了37.18%和42.31%。因此,亨氏馬尾藻提取物可能具有潛在降低動(dòng)脈粥樣硬化的功效。

表3 亨氏馬尾藻提取物對(duì)試驗(yàn)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)的影響Table 3 Effect of S.henslowianum extract on atherosclerosis index of mice with hyperlipidemia

2.3 亨氏馬尾藻提取物對(duì)小鼠肝臟脂質(zhì)水平及脂蛋白脂酶活性的影響

為了進(jìn)一步考查實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的脂肪代謝情況,對(duì)小鼠肝臟中的脂質(zhì)水平進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明(表4),各組小鼠的TC雖無(wú)明顯變化,但與模型組相比,亨氏馬尾藻提取物低劑量處理組的TG、LDL-C及高劑量處理組的TG含量顯著下降(p<0.05),高劑量處理組的LDL-C有所下降,但并不顯著,其中TG分別下降了19.53%和15.81%,LDL-C分別下降了17.39%和8.70%。

表4 亨氏馬尾藻提取物對(duì)試驗(yàn)小鼠肝臟脂質(zhì)水平以及脂蛋白脂酶活性的影響Table 4 Effect of S.henslowianum extract on hepatic lipid and LPL activity of mice with hyperlipidemia

表5 亨氏馬尾藻提取物對(duì)小鼠肝臟的抗氧化作用Table 5 Effect of S.henslowianum extract on hepatic antioxidant status of mice with hyperlipidemia

LPL主要是催化TG水解,在乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白(VLDL)的降解中發(fā)揮重要作用。瞿羽佳等[12]通過(guò)研究指出Triton WR-1339誘發(fā)的急性高血脂模型可能與LPL活力有關(guān)系。本研究結(jié)果顯示,低劑量組和高劑量組的LPL活力均高于模型組,其中低劑量組變化尤其顯著,推測(cè)亨氏馬尾藻提取物的降脂活性可能與增強(qiáng)LPL活性有關(guān)。

2.4 亨氏馬尾藻提取物對(duì)高血脂癥小鼠肝臟的抗氧化作用

與正常對(duì)照組相比,高脂誘導(dǎo)后小鼠肝臟中的T-AOC、CAT活力顯著降低,MDA含量顯著上升,SOD也有一定程度的下降,但不顯著,說(shuō)明Triton WR-1339誘導(dǎo)的急性高血脂會(huì)并發(fā)體內(nèi)氧化-還原系統(tǒng)失衡。與高脂模型組相比,低劑量組和高劑量組的T-AOC均增加,其中低劑量組可達(dá)到正常對(duì)照組水平相當(dāng);低劑量和高劑量組的CAT活力顯著高于模型組,同時(shí)MDA含量也顯著低于模型組,分別減少34.74%和28.82%,SOD活力高于正常組和模型組,但無(wú)顯著差異性。這些指標(biāo)水平顯示出與劑量存一定的相關(guān)性,即低劑量組對(duì)肝臟氧化還原系統(tǒng)的作用優(yōu)于高劑量組。

血脂含量的高低與人體健康密切相關(guān),高血脂癥是血脂代謝異常所導(dǎo)致,主要表現(xiàn)為血漿中TC、TG和LDL-C水平過(guò)高或HDL-C過(guò)低。HDL-C將其它器官中積累過(guò)多的膽固醇運(yùn)送到肝臟進(jìn)行分解,而LDL-C則將肝臟合成的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至全身其它器官和組織,LDL-C過(guò)高,將會(huì)引起膽固醇在血管壁上的沉積[20-21]。有研究報(bào)道,張氏馬尾藻、鼠尾藻、羊棲菜等馬尾藻提取物[22-25]具有顯著的降血脂作用。其中,與高脂模型組對(duì)比,羊棲菜治療組的高脂大鼠血清中LDL-C降低23.14%,HDL-C上升43.33%,肝臟組織勻漿LPL酶活力增強(qiáng)46.08%[24],海帶治療組中TG、TC分別下降46.99%、25.91%[4]。本研究結(jié)果中與高脂模型組對(duì)比,灌胃亨氏馬尾藻提取物后的高脂小鼠血清LDL-C降低21.71%,HDL-C上升30.18%,TG、TC分別下降12.61%、8.19%,肝臟組織勻漿LPL酶活力增強(qiáng)21.82%。雖然亨氏馬尾藻的降血脂效果低于羊棲菜和海帶,但是和灌胃方式及提取方法的不同可能存在一定的關(guān)系。文中研究結(jié)果表明亨氏馬尾藻醇提取物仍能有效緩解脂質(zhì)代謝紊亂造成脂質(zhì)在體內(nèi)的沉積。

盡管尚未確切清楚高血脂癥與脂質(zhì)過(guò)氧化之間的機(jī)制,但是研究表明兩者間關(guān)系密切,高血脂癥引發(fā)機(jī)體體內(nèi)氧化-還原系統(tǒng)失衡。近年來(lái),大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和臨床醫(yī)學(xué)研究證明抗氧化劑對(duì)防治高血脂癥引起的動(dòng)脈粥樣硬化有確切作用[2,25]?？寡趸w系可分為酶促與非酶促體系,酶類(lèi)抗氧化體系主要由SOD、CAT等內(nèi)源性抗氧化酶組成,非酶抗氧化劑主要為VE、天然化合物(酚類(lèi)等)等。內(nèi)源性抗氧化酶可以抑制脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化作用,從而抑制多余脂質(zhì)蓄積在血管內(nèi),有效防止動(dòng)脈硬化。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,能引起細(xì)胞損傷,測(cè)定其含量可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化以及細(xì)胞受損程度。本研究結(jié)果表明,高血脂癥模型SOD、CAT活力以及總抗氧化能力降低,可能是由于注射Triton WR-1339導(dǎo)致機(jī)體血脂升高并發(fā)生自氧化,產(chǎn)生過(guò)量自由基,破壞機(jī)體自由基產(chǎn)生和清除的平衡系統(tǒng),引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng),從而降低酶活力。灌胃亨氏馬尾藻提取物后,CAT、SOD酶活力升高,總抗氧化能力增強(qiáng),同時(shí)MDA含量顯著下降,有效防治高血脂引起的脂質(zhì)過(guò)氧化,促進(jìn)機(jī)體內(nèi)系統(tǒng)平衡,而且低劑量組對(duì)肝臟氧化還原系統(tǒng)的作用優(yōu)于高劑量組。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明亨氏馬尾藻醇提取物能夠顯著降低高脂血癥小鼠體內(nèi)TC、TG、LDL-C,而使HDL-C以及LPL活力顯著增加,顯著改善小鼠動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)AI1和AI2;同時(shí),增強(qiáng)小鼠肝臟T-AOC和CAT活力,而使MDA水平顯著降低,說(shuō)明亨氏馬尾藻醇提取物能有效降低高血脂水平,增強(qiáng)抗氧化能力,為亨氏馬尾藻在降血脂和抗氧化性能方面的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。