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(南京農(nóng)業(yè)大學(xué),肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部肉品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇省肉類生產(chǎn)加工與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095)

肌紅蛋白是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的色素蛋白,由一條多肽鏈與一個(gè)血紅素輔基構(gòu)成,其含量與狀態(tài)是影響肉色的重要因素,對(duì)于肉品外觀評(píng)定具有重要意義[1-3]。處于還原態(tài)的肌紅蛋白為紫紅色;當(dāng)它與氧結(jié)合后,生成鮮紅色的氧合肌紅蛋白,是新鮮肉的標(biāo)志;肌紅蛋白和氧合肌紅蛋白均可被進(jìn)一步氧化成為褐色的高鐵肌紅蛋白,使肉色變暗,此時(shí)血紅素中心的鐵離子被氧化為正三價(jià)態(tài)[4]。

大部分的肉制品都需要經(jīng)過加熱之后才會(huì)被食用,加熱處理會(huì)改變?nèi)獾鞍踪|(zhì)的理化與結(jié)構(gòu)特性,進(jìn)而對(duì)肉制品的品質(zhì)產(chǎn)生影響。肌紅蛋白作為主要的肌漿蛋白之一,熱處理會(huì)使其發(fā)生變性,嚴(yán)重影響肉色等品質(zhì)特征,并且導(dǎo)致其對(duì)消化酶的敏感性發(fā)生變化,進(jìn)一步影響到肉及肉制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。Joseph等[5]研究表明,肉中肌紅蛋白隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)變性程度不斷增加;Berisha等[6]發(fā)現(xiàn),肌紅蛋白在100 ℃加熱時(shí)，蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化;王琳可[7]發(fā)現(xiàn)不同溫度下加熱雞肉,肉中三種形式的肌紅蛋白所占比例不同,且會(huì)出現(xiàn)一個(gè)使肌紅蛋白狀態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵溫度。黃明等[8]研究表明，豬肉色澤隨加熱溫度增加而增加;黃甜和李升升等[9-10]研究表明，加熱后雞肉和牛肉亮度值L*和紅度值a*會(huì)發(fā)生變化,同時(shí)熱處理會(huì)使肉品質(zhì)下降。

目前,對(duì)于肌紅蛋白的研究主要集中在對(duì)肉品呈色機(jī)理的探討和肉品色澤的評(píng)定。而應(yīng)用模擬體系,對(duì)加工過程中的物理因素導(dǎo)致肌紅蛋白結(jié)構(gòu)變化進(jìn)而影響肉品質(zhì)的研究尚不深入。本研究利用多種光譜技術(shù),重點(diǎn)研究加熱處理對(duì)純肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的影響,以期為實(shí)際熱加工引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的變化提供理論基礎(chǔ),為肉類加工與合理消費(fèi)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬骨骼肌肌紅蛋白 美國(guó)Sigma Aldrich公司;鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)等 均為分析純。

TW 20水浴鍋 德國(guó)Julabo公司;Fiveeasy臺(tái)式pH計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司;J-1500圓二色譜儀 日本JASCO公司;UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;RF-5301熒光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌紅蛋白溶液的制備及處理 配制10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含10 mmol/L Na2HPO4與10 mmol/L NaH2PO4,pH7.0)。將肌紅蛋白溶解于上述磷酸鹽緩沖液,配制為0.5、2 mg/mL的蛋白溶液。將配制好的肌紅蛋白溶液分別置于60、70和80 ℃水浴中加熱20 min,然后將樣品從水浴鍋中取出并迅速浸入冰中,待溶液中心溫度恢復(fù)至室溫后,進(jìn)行下述測(cè)定。

1.2.2 紫外-可見吸收光譜 取3 mL肌紅蛋白溶液(0.5 mg/mL),置于石英比色皿中,以10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液為參比,測(cè)定并記錄250～650 nm的紫外-可見吸收光譜。

1.2.3 內(nèi)源熒光光譜 取3 mL肌紅蛋白溶液(0.5 mg/mL),置于1 cm石英比色皿中,以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng),在熒光分光光度計(jì)上記錄300～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。

1.2.4 同步熒光光譜 取3 mL肌紅蛋白溶液(0.5 mg/mL),置于1 cm石英比色皿中,改變發(fā)射波長(zhǎng)λem與激發(fā)波長(zhǎng)λex之間的波長(zhǎng)差Δλ,λem=λex+Δλ[11]。固定Δλ分別為30和60 nm,同時(shí)對(duì)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，并記錄相應(yīng)波長(zhǎng)范圍內(nèi)的同步熒光光譜。

1.2.5 圓二色光譜 移取200 μL處理后肌紅蛋白溶液(0.5 mg/mL)于0.1 cm的石英樣品池,測(cè)定190～250 nm波長(zhǎng)范圍的光譜[12]。設(shè)置測(cè)量參數(shù)為:掃描速率200 nm/min,帶寬1 nm,分辨率0.5 nm,響應(yīng)時(shí)間1 s,掃描次數(shù)3次,取平均值。

1.2.6 表面疏水性的測(cè)定 肌紅蛋白的表面疏水性測(cè)定參考Schma等[13]的ANS探針方法,并略做改動(dòng)。取20 μL的ANS溶液(10 mmol/L,pH7.0的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液配制)與2 mL肌紅蛋白溶液混勻(2 mg/mL),室溫避光0.5 h后,以375 nm為激發(fā)波長(zhǎng),記錄465 nm處熒光的強(qiáng)度變化。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)處理組設(shè)置五個(gè)重復(fù),進(jìn)行上述各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定并進(jìn)行相關(guān)參數(shù)分析,用SAS 8.0對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差的分析計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外-可見吸收光譜

蛋白質(zhì)中的芳香氨基酸殘基側(cè)鏈和肽鍵對(duì)光的吸收會(huì)產(chǎn)生紫外光譜[14]。蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化會(huì)導(dǎo)致紫外吸收的光譜變化,因此蛋白質(zhì)構(gòu)象信息可由紫外吸收光譜的變化反映。如圖1,對(duì)肌紅蛋白溶液進(jìn)行250～650 nm的全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)其紫外-可見吸收光譜特征符合高鐵肌紅蛋白光譜特征,可見實(shí)驗(yàn)所購肌紅蛋白幾乎全部為高鐵肌紅蛋白形式。

圖1 加熱溫度對(duì)肌紅蛋白紫外-可見吸收光譜的影響Fig.1 Effect of heating temperature on UV-VIS spectroscopy of myoglobin注:a為Soret帶;b為Q帶;c為L(zhǎng)MCT帶。

當(dāng)掃描波段處于紫外光區(qū)時(shí),所有處理組肌紅蛋白特征吸收峰均在280 nm附近,這是由肽鏈上色氨酸和酪氨酸的苯雜環(huán)發(fā)生了π-π*躍遷[15]。由表1可見,樣品的紫外吸收強(qiáng)度隨溫度升高而呈降低趨勢(shì)。表明隨著溫度升高,肌紅蛋白變性程度增加,蛋白逐漸發(fā)生沉降損失,造成280 nm處吸光值顯著降低(p<0.05)。

高鐵肌紅蛋白血紅素輔基中的鐵原子是六配體,它與四個(gè)吡咯環(huán)的氮原子相連,同時(shí)其第五配位與多肽鏈的His-93殘基結(jié)合、第六配位與一個(gè)水分子結(jié)合后,分別在409 nm(Soret帶)、504 nm(Q帶)以及630 nm(LMCT帶)出現(xiàn)特征譜峰[16]。如圖1可見,當(dāng)掃描波段位于可見光區(qū)時(shí),吸收?qǐng)D譜出現(xiàn)了3處特征峰。卟啉環(huán)共軛體系的π-π*躍遷導(dǎo)致Soret帶和Q帶產(chǎn)生吸收峰,可據(jù)此分別判斷鐵卟啉結(jié)構(gòu)的變化以及鐵原子與多肽鏈的結(jié)合情況。表1為加熱溫度對(duì)紫外-可見吸收光譜特征峰的影響。由表1可知，60 ℃和70 ℃加熱時(shí),409 nm處吸收強(qiáng)度變化不顯著(p>0.05),而80 ℃加熱后該處吸光值顯著低于對(duì)照組(p<0.05),表明加熱溫度達(dá)80 ℃會(huì)導(dǎo)致鐵卟啉結(jié)構(gòu)的破壞。504 nm處的特征峰強(qiáng)度均隨著加熱溫度升高呈降低趨勢(shì)。且60 ℃加熱時(shí)504 nm處吸收強(qiáng)度即顯著低于對(duì)照組(p<0.05),可能是加熱導(dǎo)致了中心鐵原子和遠(yuǎn)端組氨酸之間的結(jié)合減弱,表明該結(jié)構(gòu)對(duì)加熱較為敏感。

表1 加熱溫度對(duì)紫外-可見吸收光譜特征峰的影響Table 1 Effects of heating temperature on spectral characteristic peaksof UV-VIS

2.2 內(nèi)源熒光光譜

肌紅蛋白的內(nèi)源熒光主要來源于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr),可靈敏反映環(huán)境對(duì)蛋白的影響,被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究[17]。如圖2,肌紅蛋白的內(nèi)源熒光最大發(fā)射峰在360 nm附近。表2為加熱溫度對(duì)同步熒光光譜特征峰的影響。由表2可見,僅80 ℃加熱使熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組(p<0.05),而60、70 ℃加熱后熒光強(qiáng)度變化不顯著(p>0.05)?？赡苁且?yàn)?，加熱溫度低?0 ℃加熱時(shí),肌紅蛋白的變性程度較小或仍未可逆變性,蛋白結(jié)構(gòu)變化較小,因而熒光強(qiáng)度變化不顯著(p>0.05)。溫度達(dá)80 ℃時(shí),蛋白變性使多肽鏈展開,疏水基團(tuán)暴露程度增高,使得熒光強(qiáng)度顯著增高(p<0.05)。

表2 加熱溫度對(duì)同步熒光光譜特征峰的影響Table 2 Effects of heating temperature on the characteristic peaks of synchronous fluorescence

圖2 加熱溫度對(duì)肌紅蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.2 Effect of heating temperature on intrinsic fluorescence spectra of myoglobin

2.3 同步熒光光譜

芳香族氨基酸引起肌紅蛋白280～400 nm處的熒光,當(dāng)Δλ=30 nm時(shí),同步熒光光譜僅表現(xiàn)酪氨酸殘基的熒光特性;當(dāng)Δλ=60 nm時(shí),僅表現(xiàn)色氨酸殘基的熒光特性。酪氨酸與色氨酸熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光變化見表2。

圖3a顯示,Δλ=30 nm時(shí),最大熒光發(fā)射峰出現(xiàn)在329 nm附近。60 ℃加熱時(shí),酪氨酸熒光光譜未見明顯改變;70 ℃時(shí),酪氨酸最大發(fā)射峰強(qiáng)度顯著降低(p<0.05);而80 ℃時(shí)顯著增加(p<0.05)。推測(cè)該現(xiàn)象與肌紅蛋白變性過程中發(fā)生的血紅素解離與多肽鏈展開有關(guān)。溫度較低時(shí),血紅素解離造成部分酪氨酸殘基的損失,而多肽鏈尚未展開,導(dǎo)致酪氨酸熒光強(qiáng)度下降;溫度較高時(shí),多肽鏈迅速展開,血紅素口袋打開,使酪氨酸熒光強(qiáng)度增大。

圖3b顯示,Δλ=60 nm時(shí),最大熒光發(fā)射峰在353 nm附近。80 ℃加熱時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著高于其他處理組(p<0.05),可能是因?yàn)槠涠嚯逆溩冃猿潭仍黾?血紅素口袋逐漸打開,色氨酸殘基暴露程度隨之增加。

圖3 加熱溫度對(duì)肌紅蛋白同步熒光光譜的影響Fig.3 Effect of heating temperature on Synchronous fluorescence spectra of myoglobin 注:a為酪氨酸殘基,Δλ=30 nm; b為色氨酸殘基,Δλ=60 nm。

同步熒光結(jié)果表明,色氨酸殘基比酪氨酸殘基對(duì)加熱處理更為敏感,在60 ℃加熱時(shí)色氨酸殘基熒光強(qiáng)度即發(fā)生顯著變化(p<0.05)。這可能與兩種氨基酸殘基的位置分布有關(guān),酪氨酸為極性基團(tuán),而色氨酸為疏水性較強(qiáng)的非極性基團(tuán)[18]。因此酪氨酸殘基分布在肌紅蛋白表面,色氨酸殘基則處于血紅素口袋中。由于酪氨酸殘基本來就在蛋白表面,因此在較低溫度加熱時(shí)，其暴露程度與對(duì)照組無顯著差異(p<0.05),而血紅素的暴露及脫落變化則較為顯著,即外界加熱對(duì)色氨酸殘基的影響更大。

2.4 圓二色譜

圓二色譜是一種測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的靈敏技術(shù)[19]。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的規(guī)律取決于肽鍵的有序排列,其排列方向決定了能級(jí)躍遷的分裂情況,因此蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,其CD譜峰隨之變化[20]。

如圖4,肌紅蛋白的圓二色光譜在192 nm附近出現(xiàn)一個(gè)正吸收峰,209和223 nm附近出現(xiàn)兩個(gè)負(fù)吸收峰,這是典型的α螺旋結(jié)構(gòu)特征CD峰,表明α-螺旋為該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要成分[21]。加熱后,CD特征峰強(qiáng)度發(fā)生略微改變,但肩峰的位置和形狀都沒有發(fā)生明顯改變,表明加熱雖然改變了蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成,但α-螺旋結(jié)構(gòu)仍占主導(dǎo)地位。肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)各成分含量見圖5。隨著加熱溫度的升高,α-螺旋呈先增后減趨勢(shì),在60 ℃加熱時(shí)增加,而加熱溫度高于70 ℃時(shí),α-螺旋含量逐漸降低,肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的無序化程度增高。Moriyama等[22]指出，當(dāng)加熱溫度低于75 ℃并且加熱后恢復(fù)至室溫時(shí),肌紅蛋白的α-螺旋含量可基本恢復(fù)至初始值,即低于75 ℃的加熱為可逆加熱;但當(dāng)加熱溫度高于75 ℃時(shí)，二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化則不可逆轉(zhuǎn),α-螺旋含量顯著降低。這與本研究結(jié)果相似,但在本研究中溫度高于70 ℃加熱時(shí)，二級(jí)結(jié)構(gòu)含量出現(xiàn)顯著變化(p<0.05),表明70 ℃時(shí)已發(fā)生不可逆加熱,可能是與之前研究的蛋白生物來源不同導(dǎo)致的差異。

圖4 加熱溫度對(duì)肌紅蛋白圓二色光譜的影響Fig.4 Effect of heating temperature on CD spectra of myoglobin

圖5 加熱溫度對(duì)肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)影響Fig.5 Effect of heating temperature on the secondary structure of myoglobin 注:不同字母表示加熱溫度不同時(shí)差異顯著(p<0.05);圖6同。

2.5 表面疏水性

疏水相互作用力是維持蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中最重要的穩(wěn)定力。以ANS作為熒光探針,可反映蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化情況[23]。通常來說,加熱會(huì)導(dǎo)致疏水氨基酸殘基的暴露,使蛋白質(zhì)的疏水性增加。以最大吸收波長(zhǎng)475 nm處熒光強(qiáng)度表征不同加熱程度處理的肌紅蛋白的疏水性,結(jié)果見圖6。加熱后肌紅蛋白表面疏水性均顯著高于對(duì)照組(p<0.05),但不同溫度處理組的結(jié)果無顯著性差異(p>0.05)。表明加熱后肌紅蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)展開,從而利于ANS與蛋白疏水部位結(jié)合。70 ℃時(shí)表面疏水性略有下降,與酪氨酸熒光的結(jié)果一致,表明70 ℃加熱時(shí)肌紅蛋白血紅素沉積的阻礙作用較為明顯。

圖6 加熱溫度對(duì)肌紅蛋白表面疏水性的影響Fig.6 Effect of heating temperature on surface hydrophobicity of myoglobin

3 結(jié)論

本研究中,隨著加熱溫度的增高,肌紅蛋白紫外可見光譜特征峰吸收強(qiáng)度降低,血紅素鐵原子與多肽鏈結(jié)合力減弱,血紅素逐漸解離沉積,蛋白變性損失;熒光光譜特征峰強(qiáng)度和表面疏水性增高,多肽鏈逐漸展開,極性基團(tuán)暴露,三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變;α-螺旋含量降低,蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的無序化程度增高。肌紅蛋白雖然具有一定的耐熱性,但高溫加熱仍會(huì)導(dǎo)致非血紅素鐵的釋放和蛋白結(jié)構(gòu)的無序化,加熱溫度不超過70 ℃時(shí)，肌紅蛋白主要發(fā)生三級(jí)結(jié)構(gòu)的局部變化,但高于70 ℃的加熱會(huì)嚴(yán)重?cái)_亂肌紅蛋白二、三結(jié)構(gòu)，且變性過程不可逆。加熱導(dǎo)致的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化還將進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)的體外消化情況[24]。實(shí)際加工中的熱處理操作應(yīng)把握好肌紅蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵溫度和加熱時(shí)間,避免過度加熱。