俞慧菊，張慧英，付卓敏，張曉玲，宋志剛，易志剛

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200092； 2. 上海市公共衛(wèi)生臨床中心病原體檢測(cè)和生物安全部，上海 201508； 3. 上海師范大學(xué)第二附屬中學(xué)，上海 200540； 4. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物系，醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是威脅5歲以下嬰幼兒健康的重要傳染病，一般癥狀較輕，但重癥患者可表現(xiàn)為無(wú)菌性腦炎、腦膜腦炎、弛緩性麻痹和肺水腫等，甚至出現(xiàn)死亡[1]。近年來(lái)，手足口病在國(guó)內(nèi)各地有暴發(fā)流行，成為嚴(yán)重威脅我國(guó)兒童健康的重要疾病。2008年，我國(guó)安徽阜陽(yáng)暴發(fā)了大規(guī)模的手足口病疫情，死亡病例達(dá)128例，病死率為 2.5/10 000[2]。因此，自2008年起國(guó)家衛(wèi)生部將手足口病納入丙類傳染病管理。

腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是重癥手足口病的主要病原體，可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，誘導(dǎo)神經(jīng)源性肺水腫，但發(fā)病機(jī)制尚不清楚。在感染性疾病進(jìn)程中患者出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴較常見(jiàn)，這往往是導(dǎo)致病情加重和死亡的重要原因。EV71感染的疾病進(jìn)程與機(jī)體免疫反應(yīng)異常密切相關(guān)，重癥手足口病患者血清中的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-10 、IL-1β、IL-13水平較高，而宿主的強(qiáng)炎癥反應(yīng)是病情惡化的重要原因[3-5]。有研究表明，雌二醇對(duì)細(xì)胞因子有明顯抑制作用，但針對(duì)重癥手足口病患者中的細(xì)胞因子變化，其血清中的雌二醇與輕癥患者相比是否存在差異，雌二醇水平與疾病嚴(yán)重程度是否相關(guān)，至今未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究收集了2010—2017年上海部分地區(qū)手足口病病例，采集鼻咽拭子、糞便、皰疹液和血液標(biāo)本，通過(guò)分子生物學(xué)方法鑒定病原種類，利用免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)血清雌二醇和細(xì)胞因子水平，探尋重癥手足口病患者中雌二醇水平與細(xì)胞因子水平的關(guān)系，為手足口病的預(yù)防和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究所選病例為 2010—2017年期間上海市公共衛(wèi)生臨床中心、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院住院的手足口病患兒，共43例，參照《手足口病診療指南(2018版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)重新分組。12例入重癥組，其中男性10例，女性2例，平均年齡(3.67±2.18歲)；31例入輕癥組，其中男性15例，女性16例，平均年齡(3.2±1.52)歲。另有23例正常體檢兒童列入對(duì)照組，其中男性13例，女性10例，平均年齡(2.14±1.57)歲。

1.2 研究方法

1.2.1EV71檢測(cè)按Qiagen RNA Mini Kit試劑盒操作步驟，提取鼻咽拭子、糞便和皰疹液等樣本RNA，純化的核酸于 -80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。采用TaKaRa公司One Step Realtime RT-PCR試劑盒，進(jìn)行EV71核酸檢測(cè)。

1.2.2雌二醇定量檢測(cè)利用化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)對(duì)血清和血漿中的雌二醇進(jìn)行定量檢測(cè)，參照雅培公司ARCHITECT I2000分析系統(tǒng)和專用試劑。

1.2.3細(xì)胞因子檢測(cè)采用Milliplex 多因子(xMAP)檢測(cè)技術(shù)對(duì)人血漿或血清中的IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)等細(xì)胞因子進(jìn)行定量測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 手足口病的臨床特征

43份手足口病標(biāo)本中，EV71核酸均陽(yáng)性，重癥組和輕癥組的人群特征、臨床特征分析詳見(jiàn)表1?？ǚ綑z驗(yàn)顯示，四肢皮疹和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀在重癥患者中出現(xiàn)的頻率更高，分別占 66.7%(P=0.018)和 33.3%(P=0.005)，與輕癥組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組之間其他人群特征和臨床特征無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1手足口病患兒的人群和臨床特征

Tab.1DemographicandclinicalcharacteristicsofHFMDcases

重癥組(n=12)輕癥組(n=31)P值年齡(歲)(x±s)3.67±2.183.2±1.520.427男性(n,%)10(83.3)15(48.4)0.082女性(n,%)2(16.7)16(51.6)0.082體溫(℃)(x±s)39.4±0.539.1±0.60.133皮疹部位 手(n,%)12(100)30(96.8)0.618 足(n,%)12(100)24(77.4)0.181 口(n,%)12(100)26(83.9)0.343 臀部(n,%)10(83.3)15(48.4)0.082 四肢(n,%)8(66.7)7(22.6)0.018其他癥狀 呼吸系統(tǒng)癥狀(n,%)2(16.7)4(12.9)0.696 神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(n,%)4(33.3)0(0)0.005

2.2 血清細(xì)胞因子變化與手足口病病情的相關(guān)性

檢測(cè)手足口病患者血清細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示，重癥組血清中IFN-γ、IL-8和IL-6水平均顯著高于輕癥組(P<0.01)，但I(xiàn)L-1β、IL-4和IL-17水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。男性與女性患者之間血清IL-1β、IL-17、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-8這6個(gè)細(xì)胞因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，血清IFN-γ、IL-8和IL-6這3個(gè)細(xì)胞因子水平與手足口病病情嚴(yán)重性相關(guān)，特別是重癥患者的IL-8水平比輕癥患者高26倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1手足口病重癥組與輕癥組血清細(xì)胞因子水平的比較

Fig.1ComparisonofserumcytokinesbetweensevereHFMDgroupandmildHFMDgroup

2.3 血清雌二醇變化與手足口病病情的相關(guān)性

檢測(cè)手足口病患者血清雌二醇水平，結(jié)果顯示，重癥組、輕癥組、健康對(duì)照組的雌二醇水平分別為(6.12±6.08)pg/mL、(30.2±10.16)pg/mL、(20.62±7.43)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。男性和女性患者的血清雌二醇水平分別為(15.84±12.27)pg/mL、(30.33±14.26 pg/mL)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.125)。

2.4 細(xì)胞因子水平與雌二醇水平的相關(guān)性

血清IL-6和IL-8水平與雌激素水平有較高的相關(guān)性(Spearmen相關(guān)系數(shù)IL-6：r=-0.890 1，P=0.003 1；IL-8：r=-0.811 3，P=0.014 5)(表2)。IL-8和IL-6水平與血清雌二醇水平呈負(fù)相關(guān)，提示雌激素與炎癥免疫反應(yīng)密切相關(guān)。然而，細(xì)胞因子INF-γ、IL-17、IL-1β和IL-4水平與雌二醇水平無(wú)相關(guān)性。

表2手足口病患兒血清雌二醇水平與細(xì)胞因子水平的相關(guān)性分析

Tab.2CorrelationbetweenserumestradiolandcytokinesinHFMDpatients

細(xì)胞因子r值R2值P值IFN-γ-0.131 80.017 370.735 4IL-17-0.271 40.073 680.479 9IL-1β-0.322 10.103 80.397 9IL-4-0.084 50.007 140.828 9IL-6-0.890 10.792 20.003 1IL-8-0.811 30.658 10.014 5

3 討論

手足口病是腸道病毒感染引起的一種兒童常見(jiàn)傳染病，病原體主要血清型包括柯薩奇病毒A型和B型、?？刹《?、新腸道病毒71型。近年來(lái)，EV71的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢(shì)，國(guó)內(nèi)各地全年均有暴發(fā)流行，發(fā)病率為 37.01/100 000～205.06/100 000，報(bào)告病死率為 6.46/100 000～51.00/100 000。手足口病的發(fā)病率和病死率位于丙類傳染病首位，已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)5歲以下兒童健康的重要疾病。雖然目前國(guó)內(nèi)EV71疫苗已上市，但手足口病疫情并未得到有效控制，其他腸道病原體一直在持續(xù)流行，重癥和死亡病例也是目前手足口病的防治重點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，重癥手足口病患者中血清細(xì)胞因子水平顯著升高，在部分患者中甚至超過(guò)60 pg/mL，尤其是血清IFN-γ、IL-8和IL-6水平在重癥與輕癥患者之間有顯著性差異。Wang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，EV71 刺激后能增強(qiáng)細(xì)胞因子分泌，尤其是Th1 細(xì)胞分泌的相關(guān)因子(IFN-γ)和促炎因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-13)顯著升高。出現(xiàn)肺水腫等重癥癥狀時(shí)，這些細(xì)胞因子會(huì)有較大升高，血液中的IL-6含量會(huì)達(dá)到峰值，甚至超過(guò)70 pg/mL[4-5]。Huang等[6]報(bào)道，外源性IL-6、IL-13和IFN-γ能誘導(dǎo)EV71感染小鼠產(chǎn)生致死性肺水腫，而肺水腫也是臨床患者病情加重和病死的重要原因。因此，血清細(xì)胞因子水平與手足口病嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。王艷春等[7]也報(bào)道，EV71感染者血清IL-6和IL-1β升高是危重癥的重要因素之一，可作為病情嚴(yán)重程度的生物標(biāo)記。Khong等[5]體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，用IL-6抗體治療能有效降低EV71感染小動(dòng)物的死亡率。免疫反應(yīng)在EV71感染的疾病進(jìn)程中起重要作用，但更深入的機(jī)制仍不清楚。此外，本研究中重癥患者血清IL-1β水平未出現(xiàn)顯著差異，與Wang等[3]報(bào)道不符，分析原因可能與檢測(cè)方法和試劑有關(guān)，也可能與宿主本身變化有關(guān)，需進(jìn)一步驗(yàn)證。

有研究[8]發(fā)現(xiàn)，雌二醇等性激素具有顯著免疫調(diào)節(jié)作用，可直接影響機(jī)體對(duì)微生物感染的免疫反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，手足口病患者中血清雌二醇水平與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，還與IL-6和IL-8水平呈負(fù)相關(guān)，雌二醇水平越高，IL-6和IL-8水平越低，病情越輕。有學(xué)者[9]認(rèn)為，雌激素可通過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺軸的作用促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素，后者通過(guò)復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)包括 IL-1β、TNF-α 在內(nèi)的多種細(xì)胞因子產(chǎn)生抑制作用。例如，IL-6同時(shí)具有促炎癥和抗炎癥作用，在抵抗微生物感染過(guò)程中起重要作用[10-11]，而雌二醇、孕酮等雌激素能通過(guò)抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體單核-巨噬細(xì)胞中的IL-6表達(dá)。Ghazeeri等[12]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素能調(diào)節(jié)人巨噬細(xì)胞中CD16的表達(dá)量，從而影響單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌 IL-1β、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子。同時(shí)，雌激素對(duì)細(xì)胞因子分泌存在濃度依賴性，在高水平雌激素條件下，雌激素抑制巨噬細(xì)胞、造骨細(xì)胞和骨髓細(xì)胞等分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子[8,10,13]。因此，雌二醇可能通過(guò)上述途徑來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，從而造成手足口病疾病進(jìn)程的差異。

國(guó)內(nèi)多地區(qū)手足口病流行病學(xué)資料顯示，手足口病患兒中男性比例高于女性，約為 1.5∶1。本研究顯示，12例重癥患兒中男女比為5∶1，而女性雌二醇水平比男性高，是否存在手足口病嚴(yán)重程度與雌激素水平相關(guān)的可能？但因病例數(shù)有限，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且未細(xì)分，不能得出兩者有相關(guān)性的結(jié)論，故需擴(kuò)大研究范圍和增加病例數(shù)，以做進(jìn)一步論證。

本研究發(fā)現(xiàn)，手足口病患者中血清雌二醇水平與細(xì)胞因子IFN-γ、IL-8和IL-6水平相關(guān)，這些指標(biāo)的變化可能影響手足口病的預(yù)后。因此，將這些指標(biāo)作為重癥手足口病臨床評(píng)估的生物標(biāo)記，在急性期關(guān)注血清雌二醇、IL-8、IL-6的表達(dá)水平，可能有助于臨床判斷疾病嚴(yán)重程度和預(yù)測(cè)疾病演變情況，提早干預(yù)治療，從而為防治重癥并發(fā)癥提供依據(jù)。本研究?jī)H在臨床上發(fā)現(xiàn)了雌二醇水平與細(xì)胞因子水平的關(guān)系，尚未能闡明雌二醇對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)信號(hào)通路和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此雌二醇在手足口病疾病進(jìn)程中的機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。