王月紅，張賽，吳根鵬，王亮，朱為

上海生物制品研究所有限責(zé)任公司, 上海 200051

水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)屬皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，人是其唯一宿主，初次感染后發(fā)生水痘。VZV具有嗜神經(jīng)性，初次感染期間，可沿感覺神經(jīng)上行，潛伏在背根和三叉神經(jīng)節(jié)；當(dāng)免疫力下降或在其他誘因下，可再次激活引起帶狀皰疹。日本學(xué)者Takahashi采用人胚肺成纖維細(xì)胞分離VZV Oka株，在人胚肺成纖維細(xì)胞、豚鼠胚成纖維細(xì)胞、人二倍體細(xì)胞WI-38和MRC-5中連續(xù)傳代，建立了VZV Oka疫苗株(vOka)。全球各地廣泛使用vOka株生產(chǎn)水痘疫苗，并用該毒株研制和生產(chǎn)帶狀皰疹疫苗，顯示了良好的安全性和有效性[1-4]。用于生產(chǎn)疫苗的vOka株未經(jīng)克隆純化，含有許多不同的單基因型病毒。早期的Sanger法測(cè)序顯示，vOka株與親本株(pOka)之間至少存在42個(gè)位點(diǎn)的差異，除少數(shù)幾個(gè)位點(diǎn)突變?yōu)橐呙缧屯猓蟛糠治稽c(diǎn)為親本型與疫苗型并存[5]。這些位點(diǎn)通常稱為單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)。隨著研究的深入和測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，更多關(guān)于各疫苗公司的Oka株病毒序列和SNP位點(diǎn)信息被報(bào)道。由于各疫苗公司毒種來源、建庫方式、細(xì)胞基質(zhì)及生產(chǎn)工藝等各不相同，疫苗病毒序列雖然非常相似，但仍存在一定的差異，不同批次之間也有差異[6-9]。本研究采用二代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)技術(shù)，對(duì)上海生物制品研究所有限責(zé)任公司(以下簡(jiǎn)稱SIBP)不同年度生產(chǎn)的水痘疫苗進(jìn)行病毒全基因組測(cè)序，分析疫苗質(zhì)量的一致性，并與日本大阪大學(xué)微生物病研究會(huì)(BIKEN)vOka毒種及不同廠家疫苗病毒序列進(jìn)行相關(guān)性比較。

1 材料與方法

1.1 材料

選取SIBP于2015—2017年生產(chǎn)的3批水痘疫苗(以2015、2016和2017表示)，以及國(guó)內(nèi)A公司(以CompA表示)于2015年生產(chǎn)的水痘疫苗。病毒RNA/DNA 提取試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1病毒核酸的提取將每支疫苗用0.5 mL注射用水溶解，采用病毒RNA/DNA提取試劑盒提取水痘病毒基因組DNA，Qubit2.0定量核酸濃度。

1.2.2測(cè)序?qū)⑻崛〉牟《竞怂針悠匪蜕虾Ｈ祟惢蚪M研究中心進(jìn)行樣品純度分析，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit構(gòu)建文庫，于Illumina Hiseq2500測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。數(shù)據(jù)經(jīng)clean后的序列，采用Bowtie2默認(rèn)參數(shù)，與參考序列(vOka株，GenBank登錄號(hào)：AB097932)進(jìn)行mapping，生成consensus sequence序列，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)堿基的組成和各自檢出頻率。

1.2.3序列分析將疫苗的consensus sequence序列與vOka和pOka(GenBank登錄號(hào)：AB097933)序列進(jìn)行比較，與pOka相同的堿基為親本型，突變堿基為疫苗型。根據(jù)疫苗型位點(diǎn)檢出頻率(proportion of vaccine-type allele，Pv)，分析SNP位點(diǎn)及其堿基組成，并對(duì)SIBP 3個(gè)不同年度生產(chǎn)的疫苗的批間一致性、SIBP生產(chǎn)的疫苗與其他公司疫苗的相關(guān)性和差異位點(diǎn)進(jìn)行分析。序列位點(diǎn)采用Dumas株(GenBank登錄號(hào)：NC_001348)的位點(diǎn)編號(hào)；分析區(qū)間為基因組上游至開放讀碼框(open reading frame，ORF)69上游，不包括含有ORF69/ORF70/ORF71在內(nèi)的反向末端重復(fù)短序列。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相關(guān)性分析采用Spearman法，平均值比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNP位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

對(duì)SIBP于2015—2017連續(xù)3年生產(chǎn)的疫苗和CompA疫苗，采用NGS技術(shù)進(jìn)行病毒全基因組測(cè)序，BIKEN工作種子批毒種、GSK公司水痘疫苗(n=2)和Merck公司水痘-帶狀皰疹疫苗(n=4)(由于毒種及序列的相似性，以下統(tǒng)稱為水痘疫苗)的測(cè)序數(shù)據(jù)取自文獻(xiàn)(采用Agilent公司的SureSelect XT v1.5標(biāo)準(zhǔn)程序制備DNA文庫，于Illumina Miseq測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序)[6]。不同疫苗序列Pv≥閾值的位點(diǎn)數(shù)見圖1。SIBP疫苗平均有77個(gè)位點(diǎn)Pv≥10%；46個(gè)位點(diǎn)Pv≥20%，在20%～80%區(qū)間分布較均勻；12個(gè)位點(diǎn)Pv≥90%。3批疫苗之間具有良好的一致性。從超過Pv閾值的疫苗型位點(diǎn)數(shù)量來看，SIBP和GSK公司的疫苗與BIKEN毒種非常接近，介于CompA與Merck公司之間，Merck公司Pv≥30%的疫苗型位點(diǎn)數(shù)量相對(duì)較低。

2.2 SIBP疫苗序列一致性分析

SIBP生產(chǎn)的3個(gè)年度疫苗中，至少出現(xiàn)2次Pv≥10%的位點(diǎn)數(shù)共76個(gè)，兩兩之間Pv最大差值<10%，與均值的最大差值<5%， 差異率≥12%的位點(diǎn)均為低頻疫苗型位點(diǎn)(Pv<22.4%)。共有40個(gè)位點(diǎn)Pv均值≥30%，其中19個(gè)位點(diǎn)導(dǎo)致氨基酸殘基變異；15個(gè)位于ORF62區(qū)域。3批疫苗中這40個(gè)位點(diǎn)的Pv值見圖2，可看出3批疫苗具有良好的一致性。Sanger測(cè)序法檢測(cè)到的混合堿基位點(diǎn)[9]被NGS法全部檢出；NGS檢出而Sanger法未檢出的混合堿基位點(diǎn)中，僅1個(gè)位點(diǎn)Pv≥30%。

圖15種水痘疫苗/毒種Oka株病毒基因序列中Pv超過閾值的位點(diǎn)數(shù)量

Fig.1ThenumberoflociwithPvexceedingthresholdintheOkaviralgenomesof5varicellavaccines/seedlot

2.3 疫苗序列相關(guān)性分析

SIBP、CompA、GSK和Merck公司的水痘疫苗毒種源于Oka株，疫苗病毒基因序列、SNP位點(diǎn)及其堿基組成極其相似。但由于來源毒種的代次和制造工藝不同，各公司疫苗基因序列仍存在一些差異。為了解不同公司的疫苗/毒種在基因水平的特征和差異，對(duì)Pv≥30%的SNP位點(diǎn)進(jìn)行比較研究。在SIBP、CompA、GSK和Merck公司疫苗病毒與BIKEN毒種的任意一個(gè)基因序列中，Pv≥30%的SNP位點(diǎn)共有48個(gè)，其中35個(gè)位點(diǎn)兩兩之間Pv最大差值≥30%。5種Oka株病毒中這35個(gè)位點(diǎn)的Pv見圖3。對(duì)35個(gè)位點(diǎn)的Pv進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析(表1)，結(jié)果表明4種疫苗均與BIKEN毒種顯著相關(guān)，但相關(guān)程度存在差異。其中，GSK公司和SIBP均與BIKEN具有非常好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)>0.9；Merck和CompA與BIKEN、GSK、SIBP的相關(guān)系數(shù)分別在 0.4 和 0.6 左右，但Merck與CompA相關(guān)性不顯著。盡管Pv差異較大，但5種病毒SNP位點(diǎn)的堿基組成基本相同，僅個(gè)別序列在某些位點(diǎn)具有獨(dú)特的突變。如 Merck公司在8744(ORF7，N46)、106001(ORF62，K1045E)，CompA在58868(ORF31，D621Y)有獨(dú)特的堿基突變，未見于其他序列?？傮w看來，SIBP和GSK公司疫苗與BIKEN毒種有適中的Pv值，大部分介于其他兩種疫苗之間；Merck公司的Pv整體偏??；CompA呈現(xiàn)兩極分布，一部分SNP比其他疫苗更趨向于疫苗型，而另一部分則以野生型為主，基因組多態(tài)性不如其他病毒。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)對(duì)5種疫苗/毒種在這35個(gè)位點(diǎn)的Pv均值進(jìn)行比較(圖4)，結(jié)果顯示BIKEN、GSK和SIBP之間無顯著差異；Merck與BIKEN之間差異顯著(P<0.05)；CompA與其他公司之間差異非常顯著(P<0.01)。

*: Locus with amino acid variation.

圖2SIBP水痘疫苗Oka株病毒基因序列中有40個(gè)位點(diǎn)的Pv均值≥30%

Fig.2The40lociwithPv≥30%intheOkaviralgenomeofSIBPvaricellavaccine

*: Locus with amino acid variation.

圖35種水痘疫苗/毒種Oka株病毒基因序列中有35個(gè)位點(diǎn)的Pv值最大差異≥30%

Fig.3The35lociintheOkaviralgenomesof5varicellavaccines/seedlotwithmaximumdifferenceofPv≥30%

表15種水痘疫苗/毒種Oka株病毒序列之間35個(gè)位點(diǎn)的Pv相關(guān)性分析

Tab.1ThecorrelationanalysisofPvin35lociintheOkaviralgenomesof5varicellavaccines/seedlot

PR2MerckBIKENGSKSIBPCompAMerck0.008 0.003 0.007 0.147BIKEN0.438<0.001<0.001<0.001GSK0.4820.973<0.001<0.001SIBP0.4450.9200.963<0.001CompA0.2500.6220.6140.653

R2: Spearman correlation value;P: Spearman correlation test.

*P<0.05,**P<0.01, Mann-WhitneyUtest.

圖45種水痘疫苗/毒種Oka株病毒基因序列在35個(gè)位點(diǎn)的Pv分布

Fig.4ThedistributionsofPvin35lociintheOkaviralgenomesof5varicellavaccines/seedlot

3 討論

SIBP從BIKEN引進(jìn)Oka株毒種及水痘疫苗生產(chǎn)技術(shù)，率先實(shí)現(xiàn)了水痘疫苗的國(guó)產(chǎn)化。GSK和Merck公司的水痘疫苗毒種也來自BIKEN。雖然毒種來源相同，各公司疫苗病毒序列之間仍存在一些差異，但同一產(chǎn)品的批間差異很小[8,10-11]。我國(guó)有4種國(guó)產(chǎn)水痘疫苗上市，采用Sanger法對(duì)疫苗或毒種進(jìn)行測(cè)序研究[9,12-13]。本研究首次報(bào)道采用NGS對(duì)SIBP疫苗的測(cè)序結(jié)果，并與其他公司疫苗進(jìn)行比較，從分子水平分析SIBP疫苗質(zhì)量的一致性及與不同公司疫苗/毒種的相關(guān)性。SIBP在3個(gè)年度生產(chǎn)的水痘疫苗中，Pv≥10%和Pv≥30%的SNP位點(diǎn)分別為77個(gè)和40個(gè)，其中分別有28個(gè)和15個(gè)位于ORF62區(qū)域。ORF62及其上下游非編碼區(qū)的變異被認(rèn)為與疫苗減毒密切相關(guān)，Oka株病毒超過1/3的SNP位點(diǎn)位于該區(qū)域，與文獻(xiàn)報(bào)道[6]相符。3批疫苗在SNP位點(diǎn)數(shù)量、堿基組成及Pv方面具有良好的一致性，批間Pv差值<10%，與平均值的差值<5%。研究結(jié)果表明，SIBP生產(chǎn)的水痘疫苗具有良好的病毒基因水平上的一致性。

以相同Oka株毒種制備的水痘疫苗和帶狀皰疹疫苗具有良好的批間一致性，但不同公司的水痘疫苗病毒序列仍具有明顯的差異[6]。本研究對(duì)SIBP生產(chǎn)的水痘疫苗與其他3個(gè)公司的水痘疫苗及BIKEN毒種的NGS結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明，5種Oka株病毒序列總體上具有相似的SNP位點(diǎn)與堿基組成。進(jìn)一步對(duì)35個(gè)存在較大差異的位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SIBP、GSK公司疫苗與BIKEN毒種具有非常好的相似性，而它們與Merck及CompA公司疫苗差異較大。從毒種來源代次、采用的細(xì)胞基質(zhì)及在其中傳代的次數(shù)來看，SIBP與GSK公司疫苗較為相似，與Merck公司疫苗有些差異，這可能是造成最終疫苗中Oka株病毒基因組差異的主要原因。Depledge等發(fā)現(xiàn)，BIKEN毒種與GSK、Merck公司疫苗之間有共同的137個(gè)SNP核心位點(diǎn)[6]，本研究中的35個(gè)位點(diǎn)均在此范圍內(nèi)。不同疫苗/毒種在基因序列上雖然存在微小差異，但在臨床研究中均顯示了良好的安全性和免疫原性。國(guó)外有一些疫苗所致水痘樣皮疹或帶狀皰疹的研究報(bào)道，對(duì)分離病毒株進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)某些位點(diǎn)具有異常高的親本型比例[14-16]，由此引發(fā)是否有必要純化毒種的思考。國(guó)內(nèi)未見從疫苗所致病例中分離病毒的序列分析報(bào)道。

綜上，本研究采用NGS對(duì)SIBP生產(chǎn)的水痘疫苗進(jìn)行了病毒基因序列深度分析，獲得了有關(guān)SNP位點(diǎn)、堿基組成和頻率的詳細(xì)信息，對(duì)疫苗的質(zhì)量管理提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。如能對(duì)各公司生產(chǎn)的同類疫苗積累多批數(shù)據(jù)，獲得疫苗的SNP位點(diǎn)及堿基組成頻率均值及范圍，將有可能作為表征疫苗特性的指紋圖譜，對(duì)疫苗的質(zhì)量控制、偏差分析、安全性評(píng)價(jià)、疫苗相關(guān)疾病分析等提供線索與依據(jù)。