張 雷， 冉 琴， 王 星， 李國平

哮喘是一種以可逆性氣道阻塞和氣道高反應(yīng)(airway hyperresponsivenes，AHR)為特點的慢性炎癥性疾病。全球有3.34億人深受其害，哮喘患病率每年以1%的速度增加[1]，在兒童和青少年中尤為顯著。空氣動力直徑<2.5 μm的顆粒物，也稱為人肺可吸入顆粒物，對呼吸系統(tǒng)的危害極其嚴重，是造成煙霧污染并引起呼吸道疾病的主要污染物[2-3]。調(diào)查顯示，北京的最高日平均PM 2.5濃度是500 μg/m3，高于世界衛(wèi)生組織建議值的20倍[4]。PM 2.5的化學(xué)組成因地區(qū)及污染源的不同而差異較大，目前所知的主要組分包括：微生物成分如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、有機碳多環(huán)芳烴、微量元素、金屬離子、無機鹽等[5]。由于PM 2.5粒徑小、在空氣中滯留時間長，易避開氣管細胞纖毛等過濾機制進入下呼吸道，故在哮喘病的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)，PM 2.5的暴露能誘導(dǎo)人氣道上皮細胞(human bronchial epithelial cells,HBE)發(fā)生氧化應(yīng)激、DNA鏈斷裂及凋亡[6]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，PM 2.5通過誘導(dǎo)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)和自噬，對斑馬魚的發(fā)育有嚴重毒害作用[7]。So等在哮喘模型中發(fā)現(xiàn)激活核因子(nuclear factor,NF)-κB信號通路能誘導(dǎo)ERS的發(fā)生，導(dǎo)致展開和(或)錯誤折疊蛋白質(zhì)在ER的累積，干擾蛋白質(zhì)合成和分泌，誘導(dǎo)活性氧生成，并增加炎癥的發(fā)生[8]。ERS與哮喘炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、黏液高分泌都有密切關(guān)系[9]。現(xiàn)有的研究顯示，PM 2.5能夠誘導(dǎo)ERS，促進炎癥反應(yīng)，對支氣管上皮細胞造成損害。本研究擬采用OVA建立小鼠過敏性哮喘模型，模擬人類吸入PM 2.5的方式，探討空氣污染顆粒PM 2.5對哮喘小鼠ERS、炎癥及AH的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級6～8周齡雌性C57BL/6J小鼠24只，體質(zhì)量(20±2) g[重慶騰鑫科技公司，許可證號：SCXK(渝)2017-0001]。分籠飼養(yǎng)于恒溫(23 ℃)恒濕(相對濕度50%～70%)的清潔級西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物房中，12 h光照循環(huán)。

1.1.2試劑 卵清蛋白(ovalbumin，OVA，批號：326A0519，北京索萊寶科技有限公司);氫氧化鋁[Al(OH)3，批號：20120901，成都科龍化學(xué)品有限公司];乙酰甲膽堿(methacholine,Mch，批號：108K1232，美國Sigma-Aldrich公司);RNA simple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒、RT SuperMix試劑盒和SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；IL-17和TNF-α引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成;Mouse IL-17 Elisa 試劑盒(HTLV171101，北京安迪華泰科技有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010，上海碧云天生物技術(shù)有限公司);β-actin鼠單克隆抗體(sc-130656，美國Santa Cruz公司);GRP78鼠多克隆抗體(批號：ab21685，美國Abcam公司);CHOP鼠多克隆抗體(批號：ab11419，美國Abcam公司);IRE1兔多克隆抗體(批號：ab37073，美國Abcam公司);磷酸化IRE1兔多克隆抗體(批號：ab48187，美國Abcam公司)。

1.1.3儀器 實時熒光定量PCR儀(LightCycler480 Ⅱ，瑞士Roche公司);無創(chuàng)肺功能檢測系統(tǒng)(MaxⅠ 1420，美國 Buxco公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，電泳儀電轉(zhuǎn)移裝置(PS600，美國Hoefer公司);光學(xué)顯微鏡(DM4000B，美國Leica);全波長酶標(biāo)儀(MD Spetramax Plus384，美國Molecular Devices公司)。

1.2方法

1.2.1PM 2.5的收集和制備 2017年8-12月于人口密集、附近無工業(yè)污染的北京市區(qū)采集大氣PM 2.5樣品，粒徑≤2.5 μm，樣品收集于石英纖維濾膜上，采樣前和采樣后恒溫干燥24 h。將載有樣品的濾膜剪成3 cm×4 cm大小，浸泡于MilliQ水中，超聲震蕩洗脫3次，每次30 min。以6層醫(yī)用紗布對洗脫液進行過濾2次，濾液經(jīng)真空冷凍干燥后收集于密閉玻璃容器中-80 ℃凍存。使用前用PBS配成10 mg/mL濃度顆粒物懸液，臨用前超聲振蕩處理10 min，125 ℃高溫滅菌。

1.2.2哮喘小鼠模型的建立及處理 將24只小鼠按隨機數(shù)字表法分為陰性對照組(PBS組)、哮喘對照組(OVA組)、PM 2.5處理組(PM 2.5組)及哮喘小鼠吸入PM 2.5處理組(OVA+PM 2.5組)，每組6只。第0，7及14天，OVA組和OVA+PM 2.5組于腹腔注射0.2 mL致敏液[含25 μg OVA、1 mg Al(OH)3溶于0.2 mL PBS]致敏，PBS組和PM 2.5組腹腔注射PBS作為對照；第15～21天，OVA組和OVA+PM 2.5組小鼠用20 mg/kg戊巴比妥鈉淺麻醉后，予1 μg/μL OVA溶液50 μL滴鼻激發(fā)，OVA+PM 2.5組激發(fā)前經(jīng)鼻滴入100 μg/mL濃度的PM 2.5混懸液30 μL，PM 2.5組滴入等量PM 2.5混懸液，PBS組滴PBS作為對照，每日1次。末次激發(fā)待小鼠蘇醒后，各組小鼠檢測AHR。24 h后經(jīng)腹腔注射 50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，右肺上葉用10%甲醛溶液固定后做病理切片。余肺迅速過液氮后保存于-70 ℃冰箱備用。

1.2.3小鼠無創(chuàng)肺功能檢測 用Mch依次按0，6.25，12.5，25，50 mg/mL濃度霧化，經(jīng)過小鼠無創(chuàng)肺功能系統(tǒng)，霧化時間1 min，反應(yīng)時間3 min，對小鼠進行AHR測定。取每個濃度下反應(yīng)時間增強呼氣間歇(enchanced pause, Penh)均值作為評價AHR的指標(biāo)。Penh與經(jīng)典肺功能檢測具有高度相關(guān)性[10]，Penh=PEF/PIF(PEF為呼氣流速峰值，PIF為吸氣流速峰值)。Penh被證明與Mch刺激下的小鼠肺阻力和非動態(tài)順應(yīng)性相關(guān)，可有效檢測哮喘小鼠AHR[11]。

1.2.4肺組織蘇木精-伊紅(H-E)和過碘酸雪夫(periodic acid-schiff,PAS)染色 10%甲醛溶液浸泡固定組織24 h后，經(jīng)酒精脫水，石蠟包埋，常規(guī)H-E染色和PAS染色。200倍光學(xué)顯微鏡下觀察肺氣道、肺泡壁厚度和炎細胞浸潤等病理變化及杯狀細胞分布和黏液分泌情況,并計數(shù)杯狀細胞占氣道上皮細胞的百分比和肺組織炎癥評分，炎癥評分標(biāo)準(zhǔn)：0分表示氣道及血管周圍無炎細胞；1分表示氣道和血管周圍一層炎細胞；2分表示氣道和血管周圍2層炎細胞，4分表示氣道和血管周圍4層炎細胞；5分表示氣道和血管周圍5層及以上炎細胞。

1.2.5肺泡灌洗及細胞分類計數(shù) 小鼠麻醉后，頸部分離出氣管，暴露胸腔，結(jié)扎左肺，用1 mL的注射器抽取0.5 mL冷PBS經(jīng)氣管緩慢注入左肺，反復(fù)抽吸3次后回收BAL(回收率>80%)。將BALF 離心(4 ℃，1 500 r/min，8 min)，棄上清液，重懸沉淀進行細胞計數(shù)，H-E染色后鏡下計數(shù)BALF中性粒細胞密度和嗜酸性粒細胞(eosinophils，EOS)。

1.2.6ELISA法檢測BALF中IL-17的含量 留取BALF，參照試劑盒說明書檢測和計算BALF中IL-17的含量。

1.2.7總RNA提取與mRNA檢測 熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)檢測肺組織IL-17和TNF-α的mRNA表達。液氮中研磨肺組織，用RNA simple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒提取總RNA，RTSuperMix試劑盒進行RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。根據(jù)目的基因及擴增條件進行擴增(表1)：

表1 引物序列

以GAPDH為管家基因，參照SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒說明進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系共20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min→95 ℃變性10 s→57 ℃退火30 s→擴增45個循環(huán)→72 ℃延伸10 min。收集SYBR Green熒光信號，獲取各組Ct值:

ΔCt=Ct目的基因- Ct管家基因

ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組

采用2-ΔΔCt法計算各目的基因mRNA相對表達量。

1.2.8Western-blot檢測蛋白表達量 液氮中充分研磨肺組織，加入裂解液，混勻，冰上裂解30 min，4 ℃離心15 min，12 000 r/min。取上清，BCA法蛋白質(zhì)定量，每孔30 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，經(jīng)封閉，加入抗體GRP78，CHOP，IRE，p-IRE，β-αctin和GAPDH(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，顯影。Bio-Rad系統(tǒng)測定蛋白條帶灰度。

2 結(jié) 果

2.1H-E染色和PAS染色觀察 OVA組支氣管壁及周圍見中等數(shù)量的炎性細胞浸潤，管壁輕微增厚，管腔內(nèi)可見炎性細胞滲出，可見杯狀細胞增生及糖原分泌；PM 2.5+OVA組支氣管壁及周圍炎性細胞浸潤較OVA組明顯增多，管腔內(nèi)有大量炎性細胞滲出，管壁重度增厚(圖1A)，大量纖維化及杯狀細胞增生(圖2A)。PBS組和PM 2.5組見極少量炎癥細胞浸潤，支氣管壁未見增厚，偶見少量杯狀細胞。與OVA組比較，OVA+PM 2.5組肺組織炎癥評分升高(P<0.001，圖1B)，杯狀細胞占氣道上皮細胞百分比顯著增加(P<0.05，圖2B)。

A：肺組織蘇木精-伊紅染色， B：肺組織炎癥評分柱狀圖. PBS：磷酸鹽緩沖液； OVA：卵清蛋白； PM 2.5：空氣污染細顆粒物. PBS組：陰性對照組；OVA組：哮喘對照組；PM 2.5組：單純吸入PM 2.5對照組；OVA+PM 2.5組：哮喘小鼠吸入PM 2.5處理組. 與PBS組比較，☆：P<0.001；與OVA組比較，#：P<0.001.圖1 小鼠肺組織H-E染色觀察及炎癥評分( ×200)Fig 1 H-E staining observation and inflammatory score of lung tissue in mice( ×200)

A：氣道過碘酸雪夫染色； B：杯狀細胞占氣道上皮細胞百分比柱狀圖. PBS：磷酸鹽緩沖液； OVA：卵清蛋白； PM 2.5：空氣污染細顆粒物. PBS組：陰性對照組； OVA組：哮喘模型組； PM 2.5組：單純吸入PM 2.5組； OVA+PM 2.5組：哮喘小鼠吸入PM 2.5處理組. 與PBS組比較，☆：P<0.05；與OVA組比較，#：P<0.05.圖2 小鼠氣道PAS染色觀察及杯狀細胞百分比( ×200)Fig 2 PAS staining observation and Globlet cells of the mice airway( ×200)

2.2小鼠肺功能的Penh值 OVA組和OVA+PM 2.5組的Penh值在Mch=12.5 mg/mL時逐漸升高，與PBS組和PM 2.5組差距逐漸增大(圖3A)。在Mch=50 mg/mL濃度下，OVA組的Penh值較PBS組顯著增高(P<0.05)；OVA+PM 2.5組的Penh值較OVA組和PM 2.5組增高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3B)；PBS組與PM 2.5組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A：各組氣道高反應(yīng)趨勢圖； B：Mch=50 mg/mL時AHR柱狀圖. Penh：增強呼氣間歇值； AHR：氣道高反應(yīng)； Mch：乙酰甲膽堿； PBS：磷酸鹽緩沖液； OVA：卵清蛋白； PM 2.5：空氣污染細顆粒物. PBS組：陰性對照組； OVA組：哮喘模型組； PM 2.5組：單純吸入PM 2.5組； OVA+PM 2.5組：哮喘小鼠吸入PM 2.5處理組. 與PBS組比較，☆：P<0.05；與OVA組比較，#：P<0.05.圖3 吸入PM 2.5對哮喘小鼠肺功能Penh值的影響Fig 3 Effects of inhalation PM 2.5 on lung function Penh value in asthmatic mice

2.3BALF中炎性細胞計數(shù)及分類 與PBS組比較，OVA組EOS顯著升高(P<0.05)。OVA+PM 2.5組與OVA組比較，EOS升高，中性粒細胞升高(P<0.05，表2)；PBS組與PM 2.5組比較，細胞總數(shù)、EOS、中性粒細胞差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4細胞因子IL-17和TNF-α mRNA表達 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，OVA+PM 2.5組的IL-17 mRNA表達量較OVA組升高明顯(P<0.05)，較PM 2.5組增高(P<0.05)；OVA+PM 2.5組TNF-α的mRNA表達量較PM 2.5組升高(P<0.05，表3)，OVA組與PM 2.5組差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2各組小鼠肺泡灌洗液中細胞分類計數(shù)比較

Tab 2 Comparison of the cell classification count in the alveolar lavage of mice ×104

PBS：磷酸鹽緩沖液； OVA：卵清蛋白； PM 2.5：空氣污染細顆粒物. PBS組：陰性對照組； OVA組：哮喘模型組； PM 2.5組：單純吸入PM 2.5組； OVA+PM 2.5組：哮喘小鼠吸入PM 2.5處理組. 與PBS組比較，☆：P<0.05； 與OVA組比較，#：P<0.05； 與PM 2.5組比較，△：P<0.05.

表3各組小鼠細胞因子IL-17和TNF-α mRNA表達

Tab3Expression of cytokines IL-17 and TNF-α mRNA in each group of mice

分 組IL-17TNF-αPBS11OVA3.09±0.914.40±0.98PM 2.52.00±1.112.66±0.65OVA+PM 2.57.59±1.29# △9.29±2.16△

IL-17：白細胞介素-17； TNF-α：腫瘤壞死因子-α； PBS：磷酸鹽緩沖液； OVA：卵清蛋白； PM 2.5：空氣污染細顆粒物. PBS組：陰性對照組； OVA組：哮喘模型組； PM 2.5組：單純吸入PM 2.5組； OVA+PM 2.5組：哮喘小鼠吸入PM 2.5處理組. 與OVA組比較，#：P<0.05；與PM 2.5組比較，△：P<0.05.

2.5肺泡灌洗上清液中IL-17的含量 PBS，OVA，PM 2.5及OVA+PM 2.5組的IL-17分別為(2.76±0.02)，(4.31±0.38)，(2.80±0.15)及(6.03±0.31) pg/mL。OVA組與PBS組比較，BALF中細胞因子IL-17含量升高(P<0.05)；OVA+PM 2.5組與OVA組比較，IL-17含量升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.6內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78,p-IRE和CHOP的蛋白表達量 在哮喘模型小鼠中，ERS相關(guān)蛋白CHOP,GRP78和p-IRE表達量均增加。與OVA組比較，OVA+PM 2.5組的CHOP,GRP78和p-IRE表達量均顯著增加(P<0.05)。與PBS組比較，OVA組的CHOP增高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白電泳條帶； B：CHOP與β-actin、BIP與β-actin及p-IRE1與IRE1比值柱狀圖. CHOP：CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白； GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白； IRE1：肌醇必需酶1； p-IRE1：磷酸化肌醇必需酶1； β-actin：β-肌動蛋白； GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶； PBS：磷酸鹽緩沖液； OVA：卵清蛋白； PM 2.5：空氣污染細顆粒物. PBS組：陰性對照組； OVA組：哮喘模型組； PM 2.5組：單純吸入PM 2.5組； OVA+PM 2.5組：哮喘小鼠吸入PM 2.5處理組. 與PBS組比較，☆：P<0.05； 與OVA組比較，#：P<0.05.圖4 Western-blot分析吸入PM 2.5對哮喘小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP，GRP78和p-IRE1表達的影響Fig 4 Western-blot analyzed the effects of inhaled PM 2.5 on the expression of endoplasmic reticulum stress related protein CHOP, GRP78and p-IRE1 in mice with asthma

3 討 論

支氣管哮喘是由多種細胞(如EOS、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的一種以AHR和氣道慢性炎癥為特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病。本研究病理結(jié)果顯示，哮喘小鼠出現(xiàn)小支氣管黏膜上皮內(nèi)杯狀細胞明顯增生，黏膜的基底膜增厚，支氣管黏膜水腫，管壁周圍組織及肺間質(zhì)有炎性細胞浸潤，大量炎性細胞浸潤沖斷黏膜肌層，杯狀細胞明顯增生等改變。吸入PM 2.5能夠加重OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道損害，說明PM 2.5會加重氣道炎癥和破壞氣道結(jié)構(gòu)，增加黏液分泌。多種免疫細胞和細胞因子參與哮喘發(fā)病機制，其中CD4+T淋巴細胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)失衡在哮喘的氣道炎癥中發(fā)揮重要的作用[12]。當(dāng)CD4+T細胞被抗原激活后，通過多種途徑分化成具有不同生物學(xué)功能的細胞亞群，包括輔助性T2細胞(helperT cell 2，Th2)和產(chǎn)生IL-17的Th 17細胞[13]。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的外周血Th1/Th2、Th17/調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)比例失衡，且中重度哮喘患者的Th17細胞應(yīng)答增強[14]。Rhonda等在大鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，單獨IL-17免疫應(yīng)答或單獨Th2免疫應(yīng)答均不能引起大鼠的AHR，但在Th2和Th17免疫反應(yīng)共同作用下，大鼠出現(xiàn)了氣道EOS、中性粒細胞浸潤，并發(fā)生AHR[15]。本研究結(jié)果顯示，吸入PM 2.5的重癥哮喘小鼠IL-17表達量明顯增高，AHR增強。筆者推斷，PM 2.5加重哮喘氣道炎癥，誘導(dǎo)炎性細胞浸潤，加重AHR，可能與IL-17相關(guān)的Th17免疫狀態(tài)有關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種動態(tài)細胞器，確保細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)能在蛋白質(zhì)翻譯或折疊及炎癥和細胞凋亡過程中建立。氧化應(yīng)激、病原體感染和過敏原暴露等刺激能引起ERS，并激活UPR誘導(dǎo)不同的炎癥反應(yīng)和先天免疫功能失衡，導(dǎo)致哮喘狀況的惡化[16]。Lee等研究發(fā)現(xiàn)，HDM能誘導(dǎo)氣道上皮細胞發(fā)生ERS/UPR，ER分子伴侶BIP，GRP94和ERP57表達量升高[17]。PM 2.5也可激活ERS，從而損害斑馬魚的生育功能[7]。本研究結(jié)果顯示，吸入PM 2.5的哮喘小鼠炎癥更加嚴重，肺組織中ERS標(biāo)志蛋白GRP78和CHOP表達顯著增加，在ERS/UPR信號通路中磷酸化IRE1顯著增多，黏液分泌增加，氣道反應(yīng)性升高。Kim等在LPS+OVA聯(lián)合致敏小鼠哮喘模型中，發(fā)現(xiàn)肺組織中大量炎癥細胞浸潤，BALF中IFN-γ，IL-4，IL-5，IL-13和IL-17等炎癥因子增多，肺組織中ERS/UPR標(biāo)志物：BIP，CHOP，ATF6α，XBP1等表達量增加。炎癥細胞因子誘導(dǎo)ERS，進而又促進炎癥的發(fā)生[8]。Castaeda研究發(fā)現(xiàn)，細顆粒物PM 2.5通過誘導(dǎo)哮喘小鼠氧化應(yīng)激，增強肺組織的過敏性炎癥反應(yīng)[18]。從以上研究筆者推斷，PM 2.5能激活ERS，加重哮喘發(fā)作時炎癥反應(yīng)，其機制可能是PM 2.5進入肺組織后加重炎癥細胞浸潤，炎癥因子分泌增加，誘導(dǎo)IRE磷酸化，激活ERS，進而又促進炎癥反應(yīng)。

空氣污染顆粒PM 2.5可引起哮喘狀態(tài)下氣道上皮強烈的炎癥反應(yīng)，而炎癥過程中產(chǎn)生的細胞因子是引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白折疊錯誤和ERS誘發(fā)凋亡的原因之一。因此筆者推測，PM 2.5可能通過炎癥因子引起氣道上皮細胞發(fā)生ERS，促進氣道黏液分泌，加重AHR，從而在哮喘急性發(fā)作中發(fā)揮重要作用。ERS在吸入PM 2.5加重哮喘的作用及其分子機制尚需進一步研究，其結(jié)果將為尋找以ERS為靶點的預(yù)防哮喘急性發(fā)作治療措施提供理論和實驗依據(jù)。