趙會賢， 黃宛禎， 黃麗英

金線蓮[Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl.]為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，別名金線蘭、金線草等，主要分布在福建、浙江、云南和臺灣等地區(qū)[1]。民間以全草入藥，被視為珍稀名貴藥材,享有“藥王”、“金草”等美稱[2]。近年來的研究表明，金線蓮主要含有黃酮類、核苷類、多糖類、生物堿、微量元素等幾大類物質[3]，其經(jīng)濟價值和藥用價值日漸受到重視，因而造成了人為的過度采摘，加上其對生態(tài)環(huán)境要求嚴格，野生金線蓮資源現(xiàn)已瀕臨滅絕[4]。更有不法商家用斑葉蘭或其他廉價蘭科植物冒充金線蓮以換取高額利潤。因而，迫切需要一種可以用于鑒別金線蓮的技術手段[5]。隨著分子生物學技術在中藥學領域逐漸滲透與發(fā)展[6]，基于分子標記的限制性片段長度多態(tài)性技術(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA (random amplified polymorphism DNA,RAPD)、簡單序列重復(inter-simple sequence repeat,ISSR)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)等鑒定方法已成為中藥四大鑒定方法的重要補充[7-10]。ISSR是以聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)和電泳為核心的分子標記技術，不需要再復雜地構建基因文庫、雜交和同位素顯示等步驟，實驗簡單快速,多態(tài)性高，重復性好[11]。

目前，關于金線蓮ISSR分子標記的研究僅見3篇文獻報道[12-14]，且多是對金線蓮的產(chǎn)地或與近緣種植物的差異性進行研究。本研究采用ISSR分子標記技術，對來自福建省內不同種類、不同產(chǎn)地、不同生長方式的金線蓮進行研究，嘗試從分子水平上對其親緣關系進行區(qū)分，同時探討組織培養(yǎng)的金線蓮、種植金線蓮和野生金線蓮的遺傳特性差異。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本 20份樣本材料均于2017年3-4月購自福建省內的不同地區(qū)，經(jīng)福建醫(yī)科大學藥學院天然藥物化學學系張永紅教授鑒定為金線蓮藥材。取樣時，均選取健康無病蟲害植株頂端的前三片嫩葉作為實驗材料。樣本信息及編號如表1所示：

表1 不同金線蓮供試材料

1.1.2主要試劑 液氮；植物基因組DNA提取試劑盒(批號：DP022，GeneMark)；酶、堿基等混合物Premix TaqTM(批號：RR901A，日本Takara公司)；核酸染料Gold view(批號：DH392-5，北京鼎國昌盛生物技術有限公司)；DNA Marker(300～5 000 bp，批號：111108-50，北京天恩澤生物技術有限公司)；100 bp梯度DNA Marker(100～3 000 bp，批號：SM0321,Thermo Scientific)。

1.1.3主要儀器 渦旋震蕩儀(IKA Vortex Genius 3，杭州雷琪實驗器材有限公司)；高速冷凍離心機(Neofuge18R，力康發(fā)展有限公司)；電子天平(BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S，鞏義市予華儀器有限責任公司)；超微量分光光度計 (Nanodrop2000 Spectrophotometer，Thermo Scientific)；PCR擴增儀(T100TM Thermal Cycler，美國BIO-RAD公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+，美國BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取與檢測 選用植物基因組DNA提取試劑盒分別提取20個樣本的DNA。用超微量分光光度計檢測其濃度及純度，再用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質量、大小和完整性，保存于-20℃冰箱中備用。濃度及純度檢測結果如表2所示：20份樣本材料的基因組DNA的純度值A260/280近似分布在1.7～1.9，符合實驗需求[12]，可用于后續(xù)操作。

1.2.2PCR引物工作液的制備 根據(jù)哥倫比亞大學公布的96條ISSR引物序列，參考文獻[13-15]，優(yōu)選出30條，由上海生工公司合成。將30條引物干粉經(jīng)高速冷凍離心機(5 000 r/min，25 ℃,10 min)離心后小心開蓋，按照瓶身標注加入指定體積的ddH2O，制備30種引物的工作液，使其濃度均為10 μmol/L。

1.2.3ISSR-PCR反應體系及擴增程序的優(yōu)化 參照文獻[12,16]，設計針對本實驗的流程及參數(shù)。優(yōu)選出18號金線蓮樣本的基因組DNA，對ISSR-PCR體系中的模板和引物加入量、反應體積、反應循環(huán)數(shù)、退火溫度等進行優(yōu)化。本實驗使用Premix Taq溶液，使用時只需在制品溶液中加入模板和引物便可進行PCR反應。優(yōu)化的最終條件為：反應體積25 μL，其中包括模板DNA 1 μL(約40 ng)，引物1 μL(10 μmol/L)，ddH2O 10.5 μL，2×Premix Taq 12.5 μL。

表2供試材料的基因組DNA濃度及純度

Tab2The genomic DNA concentration and purity of the tested samples

編號100 μL洗脫液定容ρDNA(μg·mL-1)純度A260/28050 μL洗脫液定容ρDNA(μg·mL-1)純度A260/280135.51.8169.31.77242.31.7878.21.77334.31.7774.11.80427.71.7766.11.76529.71.7862.81.74644.91.7588.51.79751.31.7987.21.80843.01.7792.71.81937.21.8157.31.821029.41.8264.41.801160.91.75120.11.851237.51.7461.41.781341.01.7793.91.801441.01.7872.41.761553.21.8298.71.831671.51.76136.41.801743.41.7579.91.801834.71.7465.71.741966.31.72111.31.732052.61.6690.01.69

PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s→50～55 ℃退火30 s→72 ℃延伸40 s；循環(huán)40次，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存[17]。

ISSR-PCR擴增產(chǎn)物的檢測 按照優(yōu)化出的反應體系擴增20個樣本材料。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳成像后，最終篩選出15條多態(tài)性好，穩(wěn)定性高、擴增條帶清晰的引物進行ISSR遺傳分析，見表3。選擇0.5×TBE電泳緩沖液，在1.7%瓊脂糖凝膠電泳上加入15 μL PCR擴增產(chǎn)物，同時以300～5 000 bp和100 bp梯度兩種分子量標準作為擴增產(chǎn)物的分子量標記，凝膠中含有5% Gold view核酸染料。100 V電壓，電泳1.5 h，凝膠成像系統(tǒng)檢測拍照。引物UBC811的擴增結果如圖1所示。

圖1 引物UBC811對20個樣本的ISSR-PCR擴增結果Fig 1 ISSR-PCR amplification results of 20 samples by primer UBC811

2 結 果

2.1擴增產(chǎn)物的多態(tài)性統(tǒng)計 根據(jù)20個樣本的ISSR-PCR凝膠電泳圖，每個清晰可辨的條帶代表一個變異，在相同遷移位置上，有條帶的計為1，無帶的計為0，構建擴增位點矩陣。15個引物共擴增出130條帶，每個引物擴增條帶數(shù)如表3所示。

表3 15種引物的堿基序列及擴增條帶數(shù)

2.2遺傳相似系數(shù)和聚類關系分析 用NTSYS-Pc 2.1和POPGENE32聚類軟件，非加權配對算術平均法(unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA)進行聚類分析，得到樣本間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離矩陣如表4所示。由表4可知，19和20號樣本間遺傳相似系數(shù)為1，遺傳距離為0，其余金線蓮樣本材料間遺傳相似系數(shù)在0.647 6～0.971 4范圍內變化，遺傳距離在0.029 0～0.434 5范圍內變化。其中3號和4號樣本遺傳相似系數(shù)最大，為0.971 4；遺傳距離最小，為0.029 0，表明二者之間具有較近的親緣關系。13號樣本(南靖習禮尖葉組培金線蓮)與19和20號樣本(三明永安野生金線蓮)遺傳相似系數(shù)最小，為0.647 6，遺傳距離最大，為0.434 5，說明13號樣本與二者的親緣關系較遠。

基于ISSR-PCR擴增位點統(tǒng)計矩陣，選用UPGMA方法進行聚類分析，構建福建金線蓮樣本間聚類關系如圖2所示。用POPGENE 32軟件分析得：平均觀察等位基因數(shù)為1.619 0，平均有效等位基因數(shù)為1.374 8，平均Nei's遺傳多樣性指數(shù)為0.215 9，平均Shannon信息指數(shù)為0.322 0，多態(tài)性比率為61.90%[18]，擴增條帶的分子量大多位于300～2 000 bp。聚類分析結果最低相似系數(shù)為0.73，最高相似系數(shù)為1。當相似系數(shù)取0.78時，可將20個金線蓮樣本分為3類。

UPGMA：非加權配對算術平均法.圖2 供試樣本間UPGMA聚類關系圖Fig 2 The UPGMA clustering map of the tested samples

3 討 論

對PCR反應體系優(yōu)化時，選取每一類別中具有代表性的樣本，與優(yōu)選的引物在初始條件下進行擴增，最終擴增效果最佳的為18號金線蓮樣本和UBC811引物。在此條件下，篩選出15種ISSR引物對20份樣本材料進行遺傳多樣性分析，通過提取高純度的基因組DNA、優(yōu)化最佳的PCR反應體系和擴增程序、統(tǒng)計擴增的多態(tài)性位點，最終獲得樣本間的遺傳相似系數(shù)和親緣關系圖。結果表明，相同種類、相同產(chǎn)地的金線蓮大多可以聚為一個類群，且二者對樣本間遺傳差異性的影響超過由生長方式引起的差異。如聚類關系圖中的第一類，其中1，2，7，8，17號樣本均是種類為紅霞的金線蓮，表明同一個種類的樣本具有較近的親緣關系；第二類為標號為3，4，5，6，10，11，12 的樣本類群主要是產(chǎn)地為三明永安的金線蓮。11和12號樣本雖購自南靖，但根據(jù)廠家提供的信息，二者均源自三明，因而劃分為同一類群也屬合理。其中的3號金線蓮為組織培養(yǎng)樣本，4號金線蓮為林下種植樣本，二者遺傳相似系數(shù)最大，遺傳距離最小，具有最近的親緣關系。生物的遺傳是基因型和自然環(huán)境長期共同作用的結果，這表明經(jīng)組織培養(yǎng)的金線蓮在長期的生長過程中，對環(huán)境產(chǎn)生了適應能力，使得生長方式對其遺傳變異的影響逐漸減弱。第三類中的19和20號樣本均為三明永安野生金線蓮，分析結果顯示二者相似系數(shù)接近于1，其形態(tài)學主要區(qū)別為葉片有無明顯的金色葉脈，推測二者最初可能源自同一個品系，后來表達了不同的表型性狀，這也表明本實驗采取的分析方法具有較高的實用性和可信性。

ISSR技術作為一種鑒別種質資源親緣關系的有效和實用工具，具有較高的多態(tài)性。金線蓮作為一種名貴中草藥，福建是其主要產(chǎn)區(qū)，省內種植戶相對較多。本研究采用ISSR技術進行金線蓮的遺傳特性研究，對于日后福建省金線蓮的培育種植、資源保護、藥物開發(fā)及藥材市場的治理都具有重要的意義，同時也為野生金線蓮資源瀕臨滅絕的現(xiàn)狀提供了新的思路。后期將在此實驗基礎上繼續(xù)深入研究不同種類、產(chǎn)地及生長方式對金線蓮中一些重要化學成分和藥效的影響。