梅文楓， 朱一平， 尹幫旗， 許曉剛， 方樹(shù)彬

程序性死亡蛋白1(programmed death 1，PD-1)信號(hào)通路成為腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)之一，腫瘤細(xì)胞表面的程序性死亡配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)通過(guò)與PD-1的結(jié)合抑制了腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的免疫活性，介導(dǎo)了免疫逃逸，抗PD-1/抗PD-L1抗體通過(guò)阻斷負(fù)性免疫調(diào)節(jié)信號(hào)，阻斷免疫逃逸而殺傷腫瘤[1]。目前國(guó)際上已有5個(gè)抗PD-1/PD-L1抗體藥物獲批上市，開(kāi)發(fā)此類(lèi)藥物具有廣闊前景。

工程中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary，CHO)由于能進(jìn)行正確的翻譯后修飾，如蛋白折疊、糖基化，且重組蛋白分泌至胞外便于純化，已成為抗體藥物首選表達(dá)宿主[2-3]。為建立高表達(dá)、穩(wěn)定、質(zhì)量可控的重組CHO細(xì)胞株及培養(yǎng)工藝，前人已進(jìn)行了大量的工作，包括從營(yíng)養(yǎng)底物優(yōu)化[4-7]、代謝工程[8-10]、過(guò)表達(dá)抗凋亡基因[11-12]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]等方面改善CHO細(xì)胞表現(xiàn)。

為建立高產(chǎn)穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)工藝，有必要進(jìn)行氨基酸代謝分析，其將有助于確定營(yíng)養(yǎng)限制性成分。本研究在前期培養(yǎng)基篩選基礎(chǔ)上，在5種商業(yè)培養(yǎng)基中流加培養(yǎng)6株表達(dá)抗PD-1抗體的GS-CHO細(xì)胞，并進(jìn)行代謝分析，有助于深入理解GS-CHO的代謝和營(yíng)養(yǎng)需求，對(duì)后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)工藝及個(gè)性化培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)優(yōu)化提供理性指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)所用宿主細(xì)胞為L(zhǎng)ONZA公司的GS基因敲除的CHOK1SV GS-KO(GS-CHO)，表達(dá)抗人PD-1抗體的重組GS-CHO細(xì)胞株由實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建，抗體重鏈、輕鏈表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋法得到6株表達(dá)量較高的不同單克隆，分別命名為121，122，123，125，126，129。

1.1.2試劑 Cellvento CHO-210 Chemically Defined Medium(批號(hào):F1875785510)，Cellvento Feed-210 Chemically Defined Feed(批號(hào):F1876188515)均購(gòu)自德國(guó)Merck Millipore公司；CD011無(wú)血清培養(yǎng)基(批號(hào):150415400PM)，CD Feed 002補(bǔ)料培養(yǎng)基(批號(hào):150320400PM)均購(gòu)自中國(guó)甘肅健順生物科技有限公司；HyCloneHyCell CHO liquid medium(批號(hào):AAM209018)，Cell Boost 7a Supplement(批號(hào):ABA212153D)和Cell Boost 7b Supplement(批號(hào):AAK210346C)均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；PowerCHO-Advance(批號(hào):507440)，CHO Xtreme Feed(批號(hào):5SS073)均購(gòu)自瑞士Lonza公司；Dynamis AGT Medium(批號(hào):1805223)，EfficientFeed C+AGT Supplement(批號(hào):1805218)，CD CHO Medium(批號(hào):1805218)均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；AccQ Tag化學(xué)組件包(批號(hào):8218860431，美國(guó)Waters公司)。

1.1.3儀器 超高效液相色譜儀(UPLC H-class bio system，美國(guó)Waters公司)；CO2培養(yǎng)箱(Forma 371型，美國(guó)Thermo Scientific公司)；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(TC-20，美國(guó)Bio-Rad公司)；自動(dòng)生化分析儀(BioProfile 400，美國(guó)Nova Biomedical公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞復(fù)蘇、傳代 取在5種培養(yǎng)基中已完成馴化的凍存細(xì)胞置于37 ℃水浴中快速融解，加入新鮮培養(yǎng)基離心去上清(200×g)，細(xì)胞重懸于含25 μmol/L蛋氨酸亞氨基代砜的傳代培養(yǎng)基中搖瓶懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱，135 r/min，19 mm振幅。培養(yǎng)3～5 d后細(xì)胞密度達(dá)到3×106～5×106cells/mL傳代。

1.2.2TPP搖管批次培養(yǎng)及流加培養(yǎng) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子細(xì)胞，按5×105cells/mL接種密度接種于5種培養(yǎng)基中，置于50 mL TPP搖管中培養(yǎng)，總培養(yǎng)體積30 mL，初始體積視不同培養(yǎng)基組為總體積的60%～80%，每組設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)條件：37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱，300 r/min，19 mm振幅。取樣測(cè)定初始營(yíng)養(yǎng)物濃度，計(jì)為Day0。從Day3或Day4開(kāi)始根據(jù)相應(yīng)的補(bǔ)料方案進(jìn)行間隔補(bǔ)料，殘?zhí)菨舛鹊陀? g/L時(shí)加入一定量的300 g/L葡萄糖溶液使殘?zhí)菨舛染S持在1～2 g/L。每24 h取樣測(cè)定細(xì)胞密度及活率，上清留樣于-20 ℃保存，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)一測(cè)定抗體濃度。流加培養(yǎng)持續(xù)14 d，細(xì)胞活率低于80%時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。

1.2.3搖瓶流加培養(yǎng) 根據(jù)TPP搖管流加培養(yǎng)的情況，優(yōu)選出2種培養(yǎng)基在250 mL Erlenmeyer搖瓶中流加培養(yǎng)。CHO細(xì)胞接種條件與TPP搖管培養(yǎng)一致，總培養(yǎng)體積60 mL，初始體積視不同培養(yǎng)基組為總體積的60%～80%，每組設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)條件：37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱，135 r/min，19 mm振幅。取樣方式及流加培養(yǎng)的補(bǔ)料策略與TPP搖管培養(yǎng)相同，生化分析儀測(cè)定培養(yǎng)上清中代謝物濃度(葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸、氨等)，留樣樣品于-20 ℃保存。

1.2.4活細(xì)胞密度(viable cell density，VCD)及活率測(cè)定 采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法，細(xì)胞懸液與等體積0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻后注入細(xì)胞計(jì)數(shù)板上的測(cè)量腔室，自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)VCD及總細(xì)胞密度，并計(jì)算活率。

1.2.5抗體表達(dá)量測(cè)定 使用Waters的超高效液相色譜儀(ultra performance liquid chromatography，UPLC)，采用Applied Biosystem的PA ImmunoDetection Sensor Cartridge(2.1 mm×30 mm，20 μm)色譜柱測(cè)定抗體表達(dá)量，色譜條件如下：柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣體積10 μL，先用10 mmol/L PBS(含150 mmol/L NaCl，pH 7.2)的流動(dòng)相A平衡色譜柱4 min，再用150 mmol/L NaCl(醋酸調(diào)節(jié)pH至2.6)的流動(dòng)相B洗脫色譜柱4 min，最后再用流動(dòng)相A重新平衡色譜柱2 min，流速0.5 mL/min。根據(jù)自制抗體標(biāo)準(zhǔn)品所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品濃度。

1.2.6氨基酸濃度測(cè)定 采用柱前衍生法，樣品20倍稀釋后用Waters AccQ Tag化學(xué)組件包中的AccQ Fluor衍生劑6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate，AQC)衍生樣品中的游離氨基酸，衍生操作按AccQ Tag說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。定量分析采用Waters UPLC，F(xiàn)LR檢測(cè)器，Waters AccQ Tag Ultra氨基酸分析柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。色譜條件如下：進(jìn)樣量1 μL，流動(dòng)相A為AccQ Tag流動(dòng)相稀釋液，B為乙腈，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)250 nm，發(fā)射波長(zhǎng)395 nm，平衡色譜柱15 min，25/25/25/25 ABCD流速設(shè)定0.7 mL/min，使用組件包中的氨基酸水解標(biāo)樣進(jìn)行外標(biāo)定量。

1.2.7計(jì)算公式 積分活細(xì)胞密度(integral viable cell density，IVCD)，其中t為時(shí)間(d)，Xvt為時(shí)間t時(shí)的活細(xì)胞密度，使用梯形法則計(jì)算：

產(chǎn)物比生成速率(specific production rate，qp)，P為產(chǎn)物:

底物比消耗速率(specific consumption rate，qs)，S為底物:

得率系數(shù)Y為產(chǎn)物生成(mol)與底物消耗(mol)之比:

2 結(jié) 果

2.1高表達(dá)細(xì)胞株及流加培養(yǎng)基的初步篩選 在50 mL TPP搖管培養(yǎng)中，6株細(xì)胞株分別在5種培養(yǎng)基組合(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+補(bǔ)料培養(yǎng)基)中流加培養(yǎng)，其中PowerCHO Advance組和CD011組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，較早于Day8結(jié)束實(shí)驗(yàn)，其余3種培養(yǎng)基活率維持較好，于Day14～Day17結(jié)束實(shí)驗(yàn)(圖1)。6株細(xì)胞均在HyCell CHO培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況最好，最大活細(xì)胞密度(peak viability cell density，PVCD)及IVCD較其他培養(yǎng)基高，其次為Dynamis培養(yǎng)基，122細(xì)胞在5種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。對(duì)于HyCell CHO和Dynamis培養(yǎng)基，6株細(xì)胞的Titer和qp各組間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中122和126細(xì)胞在HyCell CHO培養(yǎng)基中表現(xiàn)最好，表達(dá)量分別為1.945和1.989 g/L(表1)。

PVCD：最大活細(xì)胞密度； IVCD：積分活細(xì)胞密度. A:PVCD圖; B:IVCD圖.圖1 6株細(xì)胞在5種培養(yǎng)基中的PVCD和IVCDFig 1 PVCD and IVCD with cell line and medium combinations

A：活細(xì)胞密度曲線(xiàn)圖； B：活率曲線(xiàn)圖.圖2 122細(xì)胞生長(zhǎng)及活率曲線(xiàn)Fig 2 Growth curve of 122 cell line

2.2搖瓶流加培養(yǎng) 通過(guò)2.1中的初步篩選確定了最優(yōu)培養(yǎng)基為HyCell CHO，在250 mL搖瓶中進(jìn)一步驗(yàn)證6株細(xì)胞在HyCell CHO中的流加培養(yǎng)情況。結(jié)果表明122細(xì)胞在HyCell CHO培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，抗體表達(dá)量最高，在Day12時(shí)VCD達(dá)到最高[(22.100±1.493)×106cells/mL]，其次是129細(xì)胞。6株細(xì)胞在該培養(yǎng)基都能夠維持較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，122細(xì)胞在Day14時(shí)細(xì)胞活率仍有96%(圖3)。對(duì)于HyCell CHO培養(yǎng)基，6株細(xì)胞的PVCD,Titer和qp各組間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中122細(xì)胞Titer最高達(dá)(2.358±0.127)g/L；121細(xì)胞雖然qp最高，但生長(zhǎng)性能較差(表2)，綜合選擇122細(xì)胞作進(jìn)一步代謝分析。

2.3代謝分析

2.3.1葡萄糖和乳酸 搖瓶流加培養(yǎng)過(guò)程中取樣測(cè)定代謝物，122細(xì)胞葡萄糖和乳酸的代謝曲線(xiàn)如圖4所示，葡萄糖濃度在細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)迅速下降，在Day2～Day7葡萄糖比消耗速率最高達(dá)-794.59 pg/cell/day，維持期通過(guò)補(bǔ)料使殘余葡萄糖濃度維持在約1～2 g/L，未造成營(yíng)養(yǎng)限制，葡萄糖比消耗速率較穩(wěn)定。乳酸濃度在細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生期開(kāi)始持續(xù)上升，乳酸從Day7由積累轉(zhuǎn)為消耗，即發(fā)生乳酸代謝切換[14-17]，在細(xì)胞維持期濃度逐步下降至較低濃度，比消耗速率基本穩(wěn)定。

2.3.2谷氨酸、谷氨酰胺和氨 細(xì)胞生長(zhǎng)延遲期(Day0～Day2)胞外谷氨酸濃度基本不變，而此時(shí)谷氨酰胺作為氮源被優(yōu)先利用，濃度迅速下降，比消耗速率為0.956 pmol/cell/day；隨著谷氨酰胺脫氨生成谷氨酸，氨濃度隨之上升，比生成速率為0.689 pmol/cell/day，最高達(dá)6.42 mmol/L，YNH4+/Gln為0.72。由于補(bǔ)料中不含谷氨酰胺，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(Day2～Day7)隨著谷氨酰胺被消耗至低濃度(<0.5 mmol/L)，谷氨酰胺合成酶開(kāi)始將谷氨酸和氨合成谷氨酰胺用于細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成而造成游離氨濃度下降，同時(shí)觀察到谷氨酰胺濃度上升。谷氨酸與乳酸在Day7同步從前期的生成模式轉(zhuǎn)換為消耗模式，提示兩者的代謝存在一定的關(guān)聯(lián)。在維持期及衰亡期(Day8～Day16)谷氨酸保持在較穩(wěn)定的濃度(約0.5 mmol/L)，氨濃度在培養(yǎng)后期逐步上升，但仍處于較低濃度(圖5)。

2.3.3必需氨基酸和非必需氨基酸 游離氨基酸經(jīng)AccQ Fluor標(biāo)記后定量分析，CHO細(xì)胞12種必需氨基酸濃度曲線(xiàn)(圖6A)和比消耗速率(圖6B)顯示，蛋氨酸比消耗速率比其他必需氨基酸更高，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期消耗最快，進(jìn)入維持期后比消耗速率保持穩(wěn)定。亮氨酸和異亮氨酸分別在Day9和Day11耗竭，由于補(bǔ)料中不含亮氨酸，后期胞外亮氨酸濃度無(wú)法檢出。蛋氨酸、異亮氨酸在補(bǔ)料培養(yǎng)基已含有的情況下仍然在培養(yǎng)中后期耗竭，說(shuō)明其為生長(zhǎng)和(或)抗體表達(dá)限制性成分，應(yīng)考慮在進(jìn)一步的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中額外補(bǔ)充。

表1 HyCell CHO，Dynamis培養(yǎng)基中Titer及平均qp

Titer：抗體表達(dá)量；qp：產(chǎn)物比生成速率.

表2 搖瓶中6株細(xì)胞在HyCell CHO培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)果

PVCD：最大活細(xì)胞密度； Titer：抗體表達(dá)量；qp：產(chǎn)物比生成速率.

A：活細(xì)胞密度曲線(xiàn)圖；B：活率曲線(xiàn)圖.圖3 HyCell CHO培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)及活率曲線(xiàn)Fig 3 The growth curve of cells in HyCell CHO medium

Gluc：葡萄糖; Lac：乳酸; qGluc：糖比消耗速率; qlac：乳酸比生成速率. A：糖和乳酸濃度圖；B：糖比消耗速率圖；C：乳酸比生成速率圖.圖4 122-Fed-batch糖和乳酸代謝曲線(xiàn)Fig 4 Curves of 122-Fed-batch glucose and lactate metabolism

Glu：谷氨酸; Gln：谷氨酰胺; NH4+：氨.圖5 122-Fed-batch谷氨酸、谷氨酰胺和氨代謝曲線(xiàn)Fig 5 Curves of 122-Fed-batch glutamic acid, glutamine and ammonia metabolism

在非必需氨基酸中(圖6C，6D),天冬氨酸及谷氨酸在Day8都消耗至較低濃度，天冬氨酸在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的比消耗速率高，到細(xì)胞的維持期和衰亡期保持約-0.026 pmol/cell/day的比消耗速率。丙氨酸在Day4～Day8不斷積累，從Day9開(kāi)始丙氨酸從生成轉(zhuǎn)換為消耗模式，濃度逐步降低。甘氨酸和絲氨酸在培養(yǎng)后期有短暫的生成積累。

His：組氨酸; Thr：蘇氨酸; Lys：賴(lài)氨酸; Met：蛋氨酸; Val：纈氨酸; Ile：異亮氨酸; Leu：亮氨酸; Phe：苯丙氨酸; Cys：半胱氨酸; Arg：精氨酸; Pro：脯氨酸; Tyr：酪氨酸; Ser：絲氨酸; Gly：甘氨酸; Asp：天冬氨酸; Glu：谷氨酸;Ala：丙氨酸. A,B：必需氨基酸濃度和比消耗速率圖；C,D：非必需氨基酸濃度和比消耗速率圖.圖6 必需氨基酸和非必需氨基酸在122-Fed-batch培養(yǎng)中消耗曲線(xiàn)Fig 6 Consumption of essential amino acids and non-essential amino acids in 122-Fed-batch culture

3 討 論

抗體表達(dá)量直接影響藥物未來(lái)商業(yè)化生產(chǎn)的制造成本，因此在抗體藥物開(kāi)發(fā)的早期階段篩選到高表達(dá)的工程細(xì)胞株具有重要意義。近年來(lái)隨著表達(dá)系統(tǒng)改造，半固體培養(yǎng)基高通量篩選、培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)等技術(shù)的進(jìn)展，抗體表達(dá)量逐步提高，大大加速了高表達(dá)細(xì)胞株建立的進(jìn)程，但同時(shí)，細(xì)胞代謝特征的篩選和考量對(duì)于建立一個(gè)穩(wěn)健、可放大、質(zhì)量可控的細(xì)胞培養(yǎng)工藝同樣重要。在CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝開(kāi)發(fā)中，乳酸及氨積累是首要關(guān)注的代謝模式，文獻(xiàn)表明，乳酸積累抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，氨積累在抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)也影響抗體表達(dá)產(chǎn)物糖基化等后修飾，導(dǎo)致抗體異質(zhì)性增加而影響質(zhì)量，因此在細(xì)胞株篩選過(guò)程中應(yīng)選擇能進(jìn)行乳酸消耗的細(xì)胞株[16]。

本研究基于前期構(gòu)建得到的6株工程細(xì)胞株，通過(guò)在多種商業(yè)培養(yǎng)基中評(píng)價(jià)，以抗體表達(dá)量、IVCD及qp等指標(biāo)進(jìn)行了篩選。Titer可表示為IVCD及qp的乘積，為提高表達(dá)量應(yīng)合理延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間及增大PVCD以獲得較大的IVCD，而不同的培養(yǎng)基也會(huì)影響qp。122細(xì)胞在Hycell CHO中的流加培養(yǎng)Titer可達(dá)(2.358±0.127)g/L，PVCD達(dá)(22.100±1.493)×106cells/mL，qp為(13.822±0.687)pg/cell/day，流加培養(yǎng)過(guò)程中能較好的維持葡萄糖濃度為1 g/L[18-19]。進(jìn)一步的代謝分析發(fā)現(xiàn)，122細(xì)胞能在Day7達(dá)到VCD峰值時(shí)進(jìn)入乳酸消耗代謝，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期積累的乳酸重新吸收，轉(zhuǎn)化為丙酮酸并進(jìn)入三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA)循環(huán)代謝，據(jù)報(bào)道乳酸消耗代謝表型往往具有較高的蛋白表達(dá)量[20]，而近期13C代謝流(metabolic flux analysis, MFA)分析技術(shù)也進(jìn)一步證實(shí)了高表達(dá)細(xì)胞株具有較高的TCA循環(huán)通量[21]。另一方面，乳酸消耗也降低了滲透壓，部分解除了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用[10,15,17]。GS-CHO細(xì)胞的谷氨酰胺合成酶能將谷氨酸與氨合成谷氨酰胺而解除氨毒性，因此培養(yǎng)過(guò)程中氨濃度除在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期上升外能保持在較低水平。代謝分析同時(shí)發(fā)現(xiàn)，122細(xì)胞培養(yǎng)中，谷氨酸濃度先上升后下降，主要是因異亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸進(jìn)入TCA循環(huán)的分解代謝耦聯(lián)了α-酮戊二酸生成谷氨酸的反應(yīng)，使得谷氨酸濃度上升，從Day7起乳酸開(kāi)始消耗代謝，TCA循環(huán)通量增強(qiáng)，α-酮戊二酸與谷氨酸的平衡反應(yīng)向生成α-酮戊二酸方向進(jìn)行，導(dǎo)致了谷氨酸濃度下降，并在后期保持較低的水平。

氨基酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和產(chǎn)物表達(dá)具有重要的影響，本研究檢測(cè)了122細(xì)胞在HyCell CHO流加培養(yǎng)中的12種必需氨基酸和5種非必需氨基酸含量變化[22]，發(fā)現(xiàn)蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸等必需氨基酸可能為生長(zhǎng)和(或)表達(dá)限制性成分，而天冬氨酸、谷氨酸在培養(yǎng)后期處于耗竭狀態(tài)，可在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步優(yōu)化添加量。丙氨酸作為糖酵解途徑產(chǎn)物丙酮酸接受轉(zhuǎn)氨而生成的氨基酸，其代謝表現(xiàn)為培養(yǎng)前期積累，在乳酸開(kāi)始消耗之后(Day9)轉(zhuǎn)為消耗，說(shuō)明細(xì)胞優(yōu)先代謝乳酸，乳酸消耗至較低濃度后積累的丙氨酸也可以重新轉(zhuǎn)化為丙酮酸進(jìn)入TCA循環(huán)代謝，在此過(guò)程中丙氨酸脫氨而導(dǎo)致游離氨濃度增加，與圖5觀察到氨濃度從Day9開(kāi)始持續(xù)上升一致[16]。

抗PD-1抗體作為腫瘤免疫治療新靶點(diǎn)，其抗體可以阻斷腫瘤逃逸機(jī)制，從而引起T細(xì)胞殺傷腫瘤，已被證實(shí)是一種具有廣闊前景的抗腫瘤藥物。本文篩選出了具有高表達(dá)量的GS-CHO工程細(xì)胞株，代謝分析和氨基酸分析對(duì)抗PD-1抗體藥物的后續(xù)大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)工藝開(kāi)發(fā)及個(gè)性化培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)，對(duì)抗PD-1抗體的產(chǎn)業(yè)化具有一定的指導(dǎo)意義。