張英華，于鑫欣，趙多佳，張 釙，孫廣梅，倪春蕾

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

玉米蛋白價(jià)格低廉、易獲取，但乳化性較低，限制其食品生產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用[1]。改善玉米蛋白乳化性可提高其應(yīng)用價(jià)值[2]。常用改性方法有物理、化學(xué)及酶法改性[3]。酶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，與化學(xué)改性相比，酶法改性以其安全、無毒、快速特點(diǎn)廣受關(guān)注[4]。

傳統(tǒng)沙拉醬為含油量較高（通?！?0%）半固體形態(tài)高脂肪乳狀液[5]。近年來，脂肪替代物作為低脂食品生產(chǎn)中重要添加劑成為研究重點(diǎn)，常用脂肪替代物分為三大類：蛋白基脂肪替代物、脂肪基脂肪替代物和碳水化合物基脂肪替代物[6]。Yazicin等利用兩種不同脂肪替代物替代酸乳中脂肪，得到與全脂酸奶產(chǎn)品相似酸奶[7]。Solowiej等以菊粉替代或部分替代脂肪，制備的干酪類似物中酪蛋白乳化特性和微觀結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)干酪類似[8]。近年來應(yīng)用碳水化合物作為脂肪替代物生產(chǎn)低脂食品研究頗多，但對(duì)蛋白基脂肪替代物研究較少。國(guó)外以蛋白質(zhì)作為脂肪替代品研究中，主要應(yīng)用蛋白質(zhì)特有空間結(jié)構(gòu)和乳化特性[9-10]。本文通過對(duì)預(yù)處理后玉米蛋白作酶改性，改善其乳化性，將改性玉米蛋白代替沙拉醬中部分油脂，使成品沙拉醬既保持原有口感和風(fēng)味，又降低脂肪含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米蛋白粉購自山東福洋生物科技有限公司；堿性蛋白酶購自廣東酶制劑有限公司；其他試劑均為分析純。

DK-98-ⅡA型恒溫水浴鍋購自常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；pHS-3C型精密PH計(jì)購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-4000KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司；UV-240IPC紫外可見分光光度計(jì)購自日本島津公司；FSH-2可調(diào)高速勻漿機(jī)購自金壇市宏華儀器廠；MAL高級(jí)流變儀購自英國(guó)馬爾文公司；DS-1高速組織搗碎機(jī)購自上海精科實(shí)業(yè)有限公司；BME100L高剪切混合乳化機(jī)購自啟東市長(zhǎng)江機(jī)電有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米蛋白粉預(yù)處理

原料玉米蛋白粉去除油脂、脂肪酸、淀粉，采用超聲波脫色處理[11]。將超聲脫色處理后玉米蛋白溶液濃縮，凍干成粉。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用凱式定氮法，參照GB/T 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)測(cè)定》。

1.2.3 水解度測(cè)定

采用pH-stat法[12]。配置質(zhì)量濃度為5 g·L-1玉米蛋白溶液于燒杯中，置于恒溫磁力攪拌水浴鍋中，加入堿性蛋白酶使其水解，用標(biāo)定濃度為0.046207 mol·L-1NaOH溶液調(diào)至所需pH，完成滴定，使pH達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。計(jì)時(shí)，到達(dá)水解時(shí)間時(shí)迅速取出，在沸水浴中加熱5 min，終止反應(yīng)。記錄此時(shí)間段水解所需NaOH體積（mL），根據(jù)公式計(jì)算水解度（DH）：

式中，VNaOH-水解時(shí)消耗NaOH體積（mL）；CNaOH-NaOH濃度；Mp-蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）；htot-每克蛋白中肽鍵當(dāng)量數(shù)（9.2 mmol·L-1）；-氨基平均解離度（1.01）。

1.2.4 優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 單因素試驗(yàn)

選取水解時(shí)間（0～120 min）、酶與底物濃度比（263.45～1 580.68 U ·g-1）、酶解溫度（30～55℃）3個(gè)因素，研究不同因素對(duì)玉米蛋白水解液乳化活性（m2·g-1）及乳化穩(wěn)定性影響，確定各因素最佳水平[13-14]。

1.2.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化水解條件

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，應(yīng)用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)[15]，優(yōu)化玉米蛋白水解工藝，利用Design-Expert 8.0.5軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。影響因素水平編碼見表1。

1.2.5 乳化性測(cè)定

采用濁度法作測(cè)定[16]。

取10 mL色拉油與質(zhì)量濃度為5 g·L-1待測(cè)液混合并不斷攪拌，8 000 r·min-1下均質(zhì)1 min。在0和10 min時(shí)分別從試管底部取出100 μL，立即用10 mL 0.1 mL·L-1SDS稀釋，稀釋液在500 nm處測(cè)吸光值，以SDS溶液作為空白。

式中， EAI為乳化活性（m2· g-1）；ESI為乳化穩(wěn)定性；A0為乳化后0時(shí)刻乳化液吸光值；A10為靜止10 min后乳化液吸光值；θ為油相所占體積分?jǐn)?shù)（0.25）；C為玉米蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（5 g·L-1）。

1.2.6 沙拉醬產(chǎn)品制作

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Experimental factors and levels

沙拉醬基本原料組成，每100 g沙拉醬中含有色拉油40 g，蛋黃粉10 g，醋3 g，水40 g，白砂糖6.2 g，鹽1.0 g，黃原膠0.8 g，變性淀粉2 g，高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2 min，得到成品。以改性玉米蛋白替代油含量（%）與改性玉米蛋白濃度（g·L-1）為單因素，討論其對(duì)沙拉醬成品流變學(xué)特性影響。

1.2.7 沙拉醬流變學(xué)分析

靜態(tài)流變學(xué)分析：選擇平行板夾具（型號(hào)P/40 mm），狹縫距離設(shè)置為500 μm。室溫下剪切速率由 0-1升至 100 s-1并保持 480 s[17-18]。

動(dòng)態(tài)流變學(xué)分析：頻率范圍為0～40 Hz，應(yīng)變?cè)O(shè)置為0.5%，測(cè)定流變參數(shù)為彈性模量G′、粘性模量G″[19]。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次試驗(yàn)平均值，采用Excel 2000和Design-Expert.V8.0.5等軟件處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米蛋白預(yù)處理結(jié)果

預(yù)處理后蛋白質(zhì)含量為：原料（0.6157±0.01）g·g-1，去脂肪（0.7177±0.03）g·g-1，去淀粉（0.8420±0.01）g·g-1，脫色處理（0.8843±0.01）g·g-1，每組試驗(yàn)平行3次。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 水解時(shí)間確定

由圖1可知，水解產(chǎn)物乳化活性升后趨于平緩，乳化穩(wěn)定性減后趨于平緩，40 min時(shí)水解產(chǎn)物乳化活性值達(dá)到最大，乳化穩(wěn)定性值達(dá)到最小，原因是前40 min內(nèi)隨水解反應(yīng)持續(xù)，肽鍵逐漸斷裂，蛋白質(zhì)分子柔性增加，油與水之間界面張力降低，乳化活性升高，乳化穩(wěn)定性則降低。40 min后隨酶解反應(yīng)開始，一方面，蛋白質(zhì)親水基團(tuán)大量暴露，親水性增加而親油性降低，乳化性略微下降；另一方面，底物逐漸耗盡，水解產(chǎn)物乳化活性及乳化穩(wěn)定性趨于平緩。乳化活性與乳化穩(wěn)定性大致呈相反趨勢(shì)。選擇酶解時(shí)間為10、40、70 min作后續(xù)響應(yīng)面分析。

2.2.2 酶與底物濃度確定

酶與底物濃度比對(duì)水解產(chǎn)物乳化活性和乳化穩(wěn)定性影響結(jié)果如圖2，乳化活性隨E/S增加而增加后趨于平穩(wěn)，在1 317.23 U·g-1時(shí)達(dá)到最大值。乳化穩(wěn)定性與其呈相反趨勢(shì)，減后趨于平穩(wěn)。酶與底物濃度比決定酶促反應(yīng)速度，酶促反應(yīng)快可加快玉米蛋白水解，提高玉米蛋白兩親性，乳化性逐漸增加，底物量決定最終水解產(chǎn)物乳化性趨于平穩(wěn)。選擇酶與底物濃度比為790.341、1 053.788、1 317.235 U·g-1作后續(xù)響應(yīng)面分析。

2.2.3 酶解溫度確定

由圖3可知，隨溫度升高乳化性逐漸升高，在45℃達(dá)到最大值，后略降，原因是酶活性受溫度影響，溫度升高促進(jìn)酶促反應(yīng)，乳化活性逐漸增加，而溫度過高則抑制酶活，45℃后乳化活性相對(duì)降低。乳化穩(wěn)定性隨溫度升高而降低，50℃時(shí)達(dá)到最低，后略有回升。由于溫度越高酶水解速度越快，肽鏈數(shù)量快速增加不利于乳液穩(wěn)定，溫度達(dá)到一定程度時(shí)，酶活降低使酶促反應(yīng)速度下降，此時(shí)蛋白水解速度平緩且結(jié)構(gòu)被打開，因此乳化穩(wěn)定性提高。選擇酶解溫度為35、40、45℃作后續(xù)響應(yīng)面分析。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

圖1 酶解時(shí)間對(duì)玉米蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性影響Fig.1 Effect of enzymolysis time on emulsifying activity and emulsion stability

圖2 酶與底物濃度比對(duì)玉米蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性影響Fig.2 Effect of ratio of enzyme and substrate concentration on emulsifying activity and emulsion stability

圖3 酶解溫度對(duì)玉米蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on emulsifying activity and emulsion stability

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)選酶解時(shí)間、酶與底物濃度比、酶解溫度3個(gè)因素，確定最佳試驗(yàn)方案，以乳化活性和乳化穩(wěn)定性為響應(yīng)值設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中包括12個(gè)分析因子，5個(gè)為零點(diǎn)，經(jīng)過零點(diǎn)試驗(yàn)估計(jì)誤差，結(jié)果見表3。表3試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過Design-Expert 8.0.5軟件中ANOVA程序分析，去除不顯著因素，得到各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值影響回歸方程模型為：

式中，EAI為乳化活性（m2· g-1）；ESI為乳化穩(wěn)定性；X1為反應(yīng)時(shí)間（min）；X2酶與底物濃度比（U ·g-1）；X3為反應(yīng)溫度（℃）。

由表4中可見，乳化活性EAI和乳化穩(wěn)定性ESI回歸方程模型極顯著（P＜0.01），2個(gè)模型失擬項(xiàng)不顯著（分別為0.2262，0.3573均大于0.05），說明該回歸方程擬合度較好，可真實(shí)反映反應(yīng)酶解時(shí)間、酶與底物濃度比E/S、反應(yīng)溫度與乳化活性和乳化穩(wěn)定性關(guān)系。

從方差分析可見，乳化活性EAI一次項(xiàng)X1、X2、X3影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；交互作用項(xiàng)X1X2、X1X3對(duì)改性玉米蛋白EAI影響顯著（P＜0.05），交互作用項(xiàng)X2X3影響不顯著，二次項(xiàng)中X12、X22對(duì)改性玉米蛋白EAI有極顯著（P＜0.01）影響，X32表現(xiàn)為不顯著。說明X1、X2與乳化活性存在線性關(guān)系和二次函數(shù)關(guān)系，各單因素間存在交互。乳化穩(wěn)定性ESI中一次項(xiàng)X1、X2和二次項(xiàng)X12影響達(dá)到極顯著水平，X3、X1X2與二次項(xiàng)X22對(duì)改性玉米蛋白乳化穩(wěn)定性影響顯著（P＜0.05）而交互作用項(xiàng)X2X3、X1X3、X32影響不顯著，說明各參數(shù)對(duì)改性玉米蛋白乳化穩(wěn)定性不僅為線性關(guān)系，X1、X2間存在交互作用，其他因素之間交互作用不明顯，各因素之間存在二次函數(shù)關(guān)系。

表3 玉米蛋白水解Box-Behnken試驗(yàn)條件及結(jié)果Table 3 Design program and experimental results of Box-Behnken experiment

表4 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance and significant analysis of Box-Behnken design test

綜上所述，以Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)回歸方程分析求解，EAI和ESI均取最大值，得到最佳方案為酶解時(shí)間33.19 min、酶與底物濃度比894.5 U·g-1、溫度為41.01℃，此時(shí)乳化活性7.423 m2·g-1、乳化穩(wěn)定性為67.17。

2.4 沙拉醬流變學(xué)分析

自制玉米蛋白沙拉醬見圖4。

2.4.1 靜態(tài)流變學(xué)分析

由圖5中剪切應(yīng)力與粘度隨剪切速率變化曲線可知，替代油含量從10%逐漸增加后，沙拉醬體系粘度降低，剪切應(yīng)力體現(xiàn)食品屈服應(yīng)力，空白樣品與10%替代油含量樣品剪切應(yīng)力曲線相似，說明二者涂抹性相似。因此改性玉米蛋白可替代沙拉醬中油脂。

圖4 自制玉米蛋白沙拉醬Fig.4 Salad made from modified corn protein

圖5 不同改性玉米蛋白替代油含量沙拉醬靜態(tài)流變曲線Fig.5 Static rheological curves of different modified corn protein replacement oil contents

由由圖6可知，在替代油含量為10%基礎(chǔ)上，改性玉米蛋白濃度從10 g·L-1逐漸增至70 g·L-1，50 g·L-1時(shí)低脂沙拉醬粘度曲線及剪切應(yīng)力曲線均與空白樣品最為接近，此時(shí)可較好模擬全脂沙拉醬粘度及涂抹性。

2.4.2 動(dòng)態(tài)流變學(xué)分析

由圖7彈性模量與粘性模量隨頻率變化曲線可知，在改性玉米蛋白替代油含量為10%和20%時(shí)，低脂沙拉醬粘性及彈性更接近傳統(tǒng)沙拉醬，替代量逐漸增加，曲線偏離空白試樣曲線，沙拉醬粘性及彈性均降低。綜合靜態(tài)流變學(xué)分析，當(dāng)替代油含量為10%時(shí)，低脂沙拉醬可較好模擬全脂沙拉醬。

由圖8彈性模量與粘性模量隨著頻率變化流變學(xué)曲線可知，當(dāng)替代油含量為10%，改性玉米蛋白濃度為30 g·L-1時(shí)，低脂沙拉醬彈性模量曲線最接近空白樣品曲線；當(dāng)改性玉米蛋白濃度為50 g·L-1時(shí)，低脂沙拉醬粘性模量曲線與空白樣品曲線相似，其次為30 g·L-1。綜合靜態(tài)流變學(xué)分析，當(dāng)改性玉米蛋白濃度為50 g·L-1時(shí)，低脂沙拉醬具有與全脂沙拉醬相似流變學(xué)特性。

圖6 不同濃度改性玉米蛋白沙拉醬靜態(tài)流變學(xué)曲線Fig.6 Static rheological curves of modified corn protein with different concentrations

圖7 不同改性玉米蛋白替代油含量沙拉醬動(dòng)態(tài)流變學(xué)曲線Fig.7 Dynamic rheological curve of different modified corn protein substitute oil content

圖8 不同濃度改性玉米蛋白沙拉醬動(dòng)態(tài)流變學(xué)曲線Fig.8 Dynamic rheological curves of modified corn protein with different concentrations

3 討論與結(jié)論

通常使用改性淀粉、菊粉、果膠、微晶纖維素、乳化劑等作為脂肪替代物制備醬體食品，但蛋白質(zhì)乳化指數(shù)較低，影響醬體食品穩(wěn)定性[20]。尚小磊等研究表明，醬體食品流變學(xué)特性對(duì)產(chǎn)品質(zhì)地及穩(wěn)定性尤為重要[21]。Shen等發(fā)現(xiàn)，蛋黃用量為10.6%，葡萄糖當(dāng)量（DE）為8.1的燕麥糊精作為脂肪替代物，脂肪替代率為27.9%時(shí)，低脂蛋黃醬產(chǎn)品比全脂蛋黃醬粘度高而卡路里值低[22]。王嫣等以20%油脂含量無蛋沙拉醬配方為基礎(chǔ)，添加5.5%變性淀粉制備低脂沙拉醬，其增稠穩(wěn)定性和感官指標(biāo)較好[23]。Bortnowska等采用預(yù)糊化馬鈴薯淀粉作為脂肪替代物制備低脂沙拉醬，添加量為5%時(shí)低脂沙拉醬具有與傳統(tǒng)沙拉醬相同質(zhì)構(gòu)性質(zhì)與紋理結(jié)構(gòu)[24]。

沙拉醬是典型醬體食品，本試驗(yàn)采用玉米蛋白作為脂肪替代物制備低脂沙拉醬。由于玉米蛋白乳化性較低，需改善其乳化性，根據(jù)玉米蛋白氨基酸組成和與堿性蛋白酶水解位點(diǎn)，選擇堿性蛋白酶水解玉米蛋白，得到乳化活性7.348 m2·g-1、乳化穩(wěn)定性為67.26的玉米蛋白水解液。傳統(tǒng)沙拉醬中含有40%的油脂，用改性玉米蛋白替代10%的油脂時(shí)，流變學(xué)特性模擬結(jié)果與傳統(tǒng)沙拉醬相似。玉米蛋白水解液的濃度影響低脂沙拉醬質(zhì)地，在油脂替代量為10%基礎(chǔ)上，濃度為50 g·L-1時(shí)模擬狀態(tài)良好，與傳統(tǒng)沙拉醬吻合。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)酶解時(shí)間、酶與底物濃度比、酶解溫度作響應(yīng)面分析。得到最佳酶解時(shí)間為33.16 min、酶與底物濃度比為895.15 U·g-1，酶解溫度為40.50℃，玉米蛋白乳化活性為7.422 m2·g-1，乳化穩(wěn)定性為67.19。