張冬杰，何鑫淼，王文濤，汪 亮，劉 娣*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150086）

民豬是我國(guó)優(yōu)良地方豬種，具有高繁殖、耐粗飼、抗逆、肉質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，但生長(zhǎng)速度慢、瘦肉率低、料肉比高。民豬是約300年前由河北和山東的大量移民經(jīng)陸路遷至遼寧西部的小型華北黑豬及海路遷至遼寧南部和中部的山東中型華北黑豬與當(dāng)?shù)刎i種雜交后，經(jīng)多年選育而成[1]。文獻(xiàn)記載，旅順郭家村發(fā)掘的晚期龍山文化遺址（距今約五千年）及黑龍江省寧安縣鏡泊湖南端的鶯歌嶺遺址（距今約三千年）[2]中均發(fā)現(xiàn)原始社會(huì)陶豬，體態(tài)與野豬區(qū)別明顯，說(shuō)明東北地區(qū)在新石器時(shí)代晚期已開始馴養(yǎng)野豬。因此，現(xiàn)存民豬具有華北黑豬和黑龍江省本地豬血統(tǒng)。但受技術(shù)條件所限，多年來(lái)僅通過(guò)表型鑒定區(qū)分豬種，無(wú)法從遺傳學(xué)角度深入分析。

隨著二代測(cè)序技術(shù)發(fā)展，可從全基因組水平分析和探討物種分子進(jìn)化、基因組成和基因調(diào)控規(guī)律[3]。Li等測(cè)定藏豬群體全基因組序列發(fā)現(xiàn)，藏豬與家豬祖先曾向不同方向進(jìn)化[4]。Ma等通過(guò)榮昌豬、松遼黑豬、大白豬和長(zhǎng)白豬全基因組掃描發(fā)現(xiàn)，受選擇區(qū)域占常染色體3.74%～5.33%，與繁殖、毛色和耳型性狀相關(guān)的多個(gè)基因受選擇[5]。Wang等通過(guò)600頭大白豬和600頭長(zhǎng)白豬全基因組掃描發(fā)現(xiàn)，與脂肪酸合成、生長(zhǎng)發(fā)育、免疫應(yīng)答等相關(guān)基因受選擇[6]。

為深入分析民豬遺傳背景，探討民豬優(yōu)良種質(zhì)特性遺傳基礎(chǔ)，有效保護(hù)和利用民豬資源，本研究以小興安嶺東北野豬為參照，利用Illumina Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)，采用雙末端測(cè)序方法，測(cè)定10頭民豬和4頭東北野豬全基因組序列，從分子水平探討民豬遺傳背景及基因組選擇情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇10頭無(wú)血緣民豬（二民豬），其中公豬4頭，母豬6頭，均來(lái)自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所民豬養(yǎng)殖基地。東北野豬4頭，均為母豬，來(lái)自黑龍江省小興安嶺林區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè)

分別采集14頭個(gè)體耳組織樣，按照常規(guī)苯酚抽提方法提取基因組DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合紫外分光光度計(jì)檢測(cè)方法，測(cè)定DNA樣品濃度，確保每個(gè)樣品DNA濃度不低于200 ng·μL-1，DNA總量不低于500 μg，OD值介于1.8～2.0。電泳檢測(cè)無(wú)明顯RNA條帶，基因組條帶清晰、完整，主帶應(yīng)在100 kb以上。

1.2.2 原始數(shù)據(jù)過(guò)濾、整理及質(zhì)量評(píng)估

按照Illumina公司操作手冊(cè)構(gòu)建14個(gè)插入片段長(zhǎng)度在425～448 bp之間文庫(kù)，利用Illumina Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)作雙末端2×100 bp測(cè)序，對(duì)所獲原始fastq格式文件作過(guò)濾和比對(duì)（mapping），過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)為平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞=Q30；總“N”堿基數(shù)＜ 3；5′端前50 bp無(wú)“N”堿基。

1.2.3 基因組重測(cè)序分析

從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index）中下載參考基因組序列（Sscrofa 10.2）。采用bwa（0.7.5a-r416）aln程序分別將經(jīng)過(guò)濾后Clean reads數(shù)據(jù)比對(duì)至參考基因組序列中，均選擇默認(rèn)參數(shù)。主要步驟包括：①對(duì)參考基因組構(gòu)建索引；②尋找輸入reads文件的SA坐標(biāo)；③生成sam格式比對(duì)文件，若一條read比對(duì)到多個(gè)位置，則隨機(jī)選擇一種。比對(duì)結(jié)束后，重新排序sam文件，利用Samtools（0.1.19）工具包將其轉(zhuǎn)換成bam文件格式，picard1.81軟件對(duì)bam文件排序。

1.2.4 SNPs分析

使用GATK基因組分析工具箱鑒定樣品SNPs，具體步驟如下：①將上述經(jīng)排序bam文件采用GATK（v2.2-14-g11728e9）程 序 中 Realigner TargetCreator命令重新比對(duì)所有Reads，提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率；②采用UnifiedGenotyper工具獲取SNPs位點(diǎn)，stand_call_conf設(shè)置為30，stand_emit_conf設(shè)置為10.0；采用Variant Filtration程序過(guò)濾上述所得SNP位點(diǎn)，將滿足以下任一條件SNPs濾掉：FS＞60，HaplotypeScore＞13.0，MQ＜40，QD＜2，MQRank Sum＜-12.5，ReadPosRankSum＜-8.0，dp＜4或dp＞50，10 bp內(nèi)包含3個(gè)或以上SNP。過(guò)濾結(jié)束后統(tǒng)計(jì)SNPs位點(diǎn)，采用Ensembl提供工具包（Variant Effect Predictor）注釋SNPs。

1.2.5 InDel分析

采用 UnifiedGenotyper（stand_call_conf設(shè)置為30，stand_emit_conf設(shè)置為10.0）命令獲取InDel信息，過(guò)濾InDel，將滿足以下任一條件InDel濾掉：QD＜2.0，ReadPosRankSum＜-20.0，F(xiàn)S＞200，dp＜4或dp＞50。過(guò)濾結(jié)束后統(tǒng)計(jì)InDel位點(diǎn)，采用Ensembl提供工具包（Variant Effect Predictor）注釋InDel。

1.2.6 群體遺傳分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載50個(gè)不同地區(qū)家豬和野豬全基因組序列，采用上述相同方法分析。使用EIGENSOFT5.0.2軟件包中smartpca軟件[7]，基于常染色體上SNPs信息作主成分分析（Principle Component Analysis，PCA）。使用MEGA 5.0軟件[8]構(gòu)建基于NJ算法不同豬種間分子進(jìn)化樹。

1.2.7 選擇性清除分析

應(yīng)用滑動(dòng)窗口方法（500 kb窗口以50 kb步滑動(dòng)）計(jì)算民豬和東北野豬群體間多態(tài)性水平（θπ）和遺傳分化（Fst）。受選擇區(qū)域應(yīng)同時(shí)滿足顯著低或高θπ比率（5%左右尾，θπ比率分別是0.659和1.770）以及顯著高Fst值（5%右尾，F(xiàn)st值是0.364）。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始數(shù)據(jù)處理與比對(duì)

10頭民豬平均獲得36.91 Gb原始數(shù)據(jù)，經(jīng)質(zhì)量過(guò)濾后獲得31.29 Gb干凈數(shù)據(jù)，平均測(cè)序深度為7.76×，其中85.46%數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組，1×測(cè)序覆蓋率至少為97.90%，4×測(cè)序覆蓋率至少為85.95%。4頭東北野豬平均獲得43.51 Gb原始數(shù)據(jù)，經(jīng)質(zhì)量過(guò)濾后獲得36.28 Gb干凈數(shù)據(jù)，平均測(cè)序深度為8.91×，其中86.27%數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組，1×測(cè)序覆蓋率至少為97.92%，4×測(cè)序覆蓋率至少為87.43%。

2.2 SNP檢測(cè)及注釋結(jié)果

10頭民豬平均檢測(cè)到8 255 874個(gè)SNPs；注釋后發(fā)現(xiàn)，發(fā)生錯(cuò)義突變SNPs數(shù)量平均為15 999個(gè)，占總數(shù)（8 255 874）的0.19%；發(fā)生同義突變SNPs數(shù)量平均為26 885個(gè)，占總數(shù)0.33%，可見基因組內(nèi)同義突變比率明顯高于錯(cuò)義突變。位于外顯子區(qū)SNPs數(shù)量平均為43 108個(gè)，占總數(shù)0.52%。大量SNPs發(fā)生在基因間區(qū)及內(nèi)含子區(qū)，分別為5 572 866個(gè)和1 991 046個(gè)，占總數(shù)67.50%和24.12%。SNP在各條染色體上分布情況見圖1。1號(hào)染色體上SNP數(shù)量最多，其次是13號(hào)染色體，Y染色體最少，僅為2227個(gè)。

4頭東北野豬基因組內(nèi)平均檢測(cè)到10 275 059個(gè)SNPs，發(fā)生錯(cuò)義突變SNPs數(shù)量平均為18 423個(gè)，占總數(shù)（10 275 059）0.18%；發(fā)生同義突變SNPs數(shù)量平均為32 341個(gè)，占總數(shù)0.31%。位于外顯子區(qū)SNPs數(shù)量平均為51 017，占總數(shù)0.50%。大量SNPs同樣發(fā)生在基因間區(qū)及內(nèi)含子區(qū)，分別為6 935 773個(gè)和2 499 832個(gè)，占總數(shù)67.50%和24.33%，各類SNPs所占比率與民豬基本相同。民豬和東北野豬SNPs數(shù)量及注釋信息見表1。

2.3 民豬和東北野豬與已知豬種SNPs信息比對(duì)

將本研究中獲得10頭民豬和4頭東北野豬SNPs信息與包含138頭豬的dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，有19 469 459個(gè)SNPs與dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中信息一致，占dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)總數(shù)68.06%，但有7 739 173個(gè)為新發(fā)現(xiàn)SNPs，可補(bǔ)充豬SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)信息。

2.4 InDel檢測(cè)及注釋結(jié)果

10頭民豬平均檢測(cè)到739647個(gè)Indel位點(diǎn)，其中相對(duì)于參照染色體純合InDel位點(diǎn)451099個(gè)，雜合InDel位點(diǎn)288548個(gè)；InDel位點(diǎn)注釋后發(fā)現(xiàn)，所有染色體上純合均多于雜合InDel位點(diǎn)，1號(hào)染色體上InDel位點(diǎn)最多，共計(jì)112 419個(gè)，占總數(shù)（739 647）15.20%，其次是13號(hào)染色體，共計(jì)81687，占總數(shù)11.04%，8號(hào)和2號(hào)染色體上InDel數(shù)量相近，分別為69 792個(gè)和69 548個(gè)。性染色體Y上InDel位點(diǎn)最少，僅151個(gè)。民豬InDel在各條染色體上分布情況見圖2。

圖1 民豬SNPs在染色體上分布情況Fig.1 Distribution of SNPs on chromosome in Min pig

圖2 民豬InDel在染色體上分布情況Fig.2 Distribution of InDel on chromosome in Min pig

4頭東北野豬平均檢測(cè)到1265842個(gè)Indel位點(diǎn)，其中相對(duì)于參照染色體純合InDel位點(diǎn)781299個(gè)，雜合InDel位點(diǎn)484542個(gè)。所有染色體上純合均多于雜合InDel位點(diǎn)，1號(hào)染色體上InDel位點(diǎn)最多，共計(jì)133841個(gè)，占總數(shù)10.57%，其次是13號(hào)染色體，共計(jì)112027，占總數(shù)8.85%，8號(hào)和2號(hào)染色體上InDel數(shù)量相近，分別為84799和84000個(gè)。性染色體Y上InDel位點(diǎn)最少，僅181個(gè)。東北野豬InDel在染色體上整體分布趨勢(shì)與民豬基本一致，但數(shù)量高于民豬。

2.5 主成分分析結(jié)果

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的包括歐洲家豬、中國(guó)家豬、亞洲野豬、歐洲野豬和疣豬5個(gè)類群共計(jì)50個(gè)SNPs數(shù)據(jù)（見表2），結(jié)合本研究中測(cè)定10頭民豬和4頭東北野豬SNPs數(shù)據(jù)，作主成分分析。通過(guò)主成分分析發(fā)現(xiàn)（見圖3），豬種聚類情況與其地理分布基本一致，疣豬屬于野豬一種，主要分布在非洲，與歐洲和亞洲豬種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，在PCA圖中與其他豬種距離最遠(yuǎn)。歐洲家豬和歐洲野豬距離最近，亞洲家豬和亞洲野豬距離最近，東北野豬與亞洲家豬、野豬聚為一類，但民豬處在歐洲和亞洲豬種之間，說(shuō)明民豬在品種形成過(guò)程中曾引入歐洲豬血統(tǒng)。

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表2 不同豬種NCBI登錄信息Table 2 NCBI login information of different pig breeds

圖3 主成分分析結(jié)果Fig.3 Principal component analysis results

2.6 分子進(jìn)化樹

基于NJ算法構(gòu)建分子進(jìn)化樹與主成分分析結(jié)果基本一致，在親緣關(guān)系上，民豬居于亞洲和歐洲豬種之間，但群體內(nèi)存在遺傳分化；東北野豬與中國(guó)北部野豬和日本野豬遺傳距離較近。具體聚類結(jié)果見圖4。

圖4 分子進(jìn)化樹Fig.4 Molecular phylogenetic tree

2.7 選擇性清除分析

同時(shí)使用θπ和Fst兩個(gè)參數(shù)篩選民豬和東北野豬基因組內(nèi)受選擇基因（見圖5）。民豬基因組內(nèi)有15.71 Mb區(qū)間受選擇，占總基因組0.559%，包含181個(gè)基因，其中有功能注釋基因118個(gè)。東北野豬基因組內(nèi)有29.81 Mb區(qū)間受選擇，占總基因組1.061%，包含411個(gè)基因，其中有功能注釋基因279個(gè)。

圖5 Fst和θπ選擇性清除分析Fig.5 Selective clearance analysis of Fst and θπ

民豬基因組中受選擇基因包括與肌節(jié)中能量轉(zhuǎn)移相關(guān)的肌酸激酶線粒體2基因（CKMT2）；作為動(dòng)力蛋白與細(xì)胞骨架相關(guān)肌球蛋白基因（MYO1C）；與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白9和15（LCN9和CN15），載脂蛋白A-V（APOA5）；與過(guò)氧化物酶合成有關(guān)過(guò)氧化物酶體的生物合成因子1（PEX1）；與脊椎發(fā)育相關(guān)VRTN基因（VRTN）；與視神經(jīng)發(fā)育相關(guān)視神經(jīng)萎縮基因（OPA1）；與脂類代謝相關(guān)促腎上腺激素釋放激素2（CRHR2）等。野豬基因組中受選擇基因包括與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)嗅覺(jué)受體基因（OR2B6，OR8b8和OR8b4）、光傳感因子3（PDCL3）和激素肽3（TAC3）；與免疫相關(guān)NLR基因家族（NLRP4和NLRP11）、干擾素-歐米伽2（IFNOMEGA-2）和叉頭框蛋白1（Foxn1）；與免疫球蛋白相關(guān)破骨細(xì)胞受體基因（OSCAR）；與雄性生殖相關(guān)羥甾類脫氫酶6（HSD17B6）、精子酵素結(jié)合蛋白（ACRBP）、附睪精子結(jié)合蛋白1（ELSPBP1）和魚精蛋白（PRM1）等；與線粒體能量代謝相關(guān)細(xì)胞色素C氧化酶（COX）和NADH脫氫酶（NDUFA9）等。

3 討論

豬是最早被馴化的家養(yǎng)動(dòng)物之一，分別在亞洲和歐洲獨(dú)立馴化。中國(guó)位于亞洲馴化中心，擁有黃河中部和東北部?jī)蓚€(gè)不同起源地[9]。從17世紀(jì)開始，中國(guó)部分地方豬種和歐洲豬種發(fā)生雜交[10]。為提高生產(chǎn)性能，中國(guó)本地豬種之間開展雜交育種，一些有利等位基因在不同豬種間交流并固定[11]。因此，中國(guó)地方豬遺傳背景比其表型更為復(fù)雜。

地方豬親緣關(guān)系和遺傳距離早期分析主要依靠線粒體基因組序列或微衛(wèi)星[12]。隨著二代測(cè)序技術(shù)成熟，從全基因組水平篩選SNP標(biāo)記并作群體遺傳分析，準(zhǔn)確度和可信度提高。本研究檢測(cè)到SNPs有68.06%與dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中一致，但仍有7 739 173個(gè)新發(fā)現(xiàn)SNPs，既可補(bǔ)充現(xiàn)有SNP數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)也是分析民豬和東北野豬種質(zhì)特性遺傳基礎(chǔ)。統(tǒng)計(jì)篩選到SNPs在染色體上分布情況發(fā)現(xiàn)，SNPs數(shù)量與染色體長(zhǎng)度呈正相關(guān)，與前人研究結(jié)果相近[13]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是SNPs還是InDel數(shù)量，東北野豬均高于民豬，表明野豬群體與家養(yǎng)民豬相比，具有豐富多樣性。可能因東北野豬為野生群體，未受高強(qiáng)度人工選擇影響。

基于全基因組SNPs信息構(gòu)建的分子進(jìn)化樹，可解決前期每個(gè)基因代表不同進(jìn)化歷程、基因橫向轉(zhuǎn)移等造成的不同基因構(gòu)建進(jìn)化樹不同的問(wèn)題[14]。本研究構(gòu)建分子進(jìn)化樹及主成分分析結(jié)果均清晰顯示，民豬在進(jìn)化關(guān)系上介于亞洲豬種和歐洲豬種之間，東北野豬與我國(guó)北方野豬及日本野豬聚于一個(gè)較大分支，與其地理分布位置相符。民豬含有部分歐洲豬血統(tǒng)，推測(cè)與黑龍江省地理位置相關(guān)，與俄羅斯存在悠久商貿(mào)歷史。據(jù)《黑龍江省志》介紹，20世紀(jì)20年代（1914～1931年），黑龍江省內(nèi)養(yǎng)豬已發(fā)展到126.2萬(wàn)頭，包括民豬及中東鐵路沿線蘇白豬，蘇白豬含部分英國(guó)大白豬血統(tǒng)。Ai等探討不同豬種間雜交現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)，豬X號(hào)染色體上存在長(zhǎng)達(dá)14 Mb低重組區(qū)，南北地方豬在該區(qū)域存在兩種不同單倍型，北方豬單倍型可能來(lái)自另一個(gè)已經(jīng)滅絕豬屬，該屬間雜交事件據(jù)推算發(fā)生于數(shù)十萬(wàn)年前[15]，說(shuō)明民豬除含有山東中型華北黑豬及歐洲豬血統(tǒng)外，還包含黑龍江省本地古老豬種血統(tǒng)。由此可見，民豬遺傳背景相對(duì)復(fù)雜，遺傳資源寶貴。

選擇性清除分析發(fā)現(xiàn)，民豬與東北野豬相比多個(gè)與脂類代謝相關(guān)基因受到選擇，主要由于早期“肥豬”選育目標(biāo)，造成與大白豬基因組中肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因受到強(qiáng)烈選擇[16]。此外，育種者通過(guò)增加體長(zhǎng)獲得更高產(chǎn)肉量，通過(guò)表型長(zhǎng)期選擇，與脊椎發(fā)育相關(guān)VRTN基因受到選擇[17]。由于家豬祖先常夜間活動(dòng)，視力較差，聽覺(jué)與嗅覺(jué)靈敏。在自然選擇作用下，決定視神經(jīng)發(fā)育OPA1基因[18]受到選擇。東北野豬作為野生動(dòng)物比家養(yǎng)動(dòng)物更適應(yīng)復(fù)雜自然環(huán)境，躲避天敵、抵抗疾病等，導(dǎo)致其基因組內(nèi)受選擇基因數(shù)量多于民豬，與神經(jīng)、免疫、生殖等性狀相關(guān)多個(gè)基因均受到選擇。Groenen等研究表明，家豬與野豬相比，參與免疫反應(yīng)和嗅覺(jué)感應(yīng)的基因快速進(jìn)化[9]。利用基因組重測(cè)序策略鑒定遺傳變異往往因參考基因組序列不完整而存在一定局限性，本研究使用豬10.2版本參考基因組序列來(lái)源于一只杜洛克家豬，一些民豬特有遺傳信息因無(wú)法比對(duì)而缺失。今后應(yīng)采用de novo組裝策略，盡快建立并完善我國(guó)地方豬基因組信息，發(fā)現(xiàn)更多新變異及新序列、基因。