陳 亮，闞君陶，田 峰，韓 強(qiáng)，李敏杰，瞿晶菁，樊柏林，杜 軍

(1 安利(中國(guó))研發(fā)中心有限公司，上海 201203；2 應(yīng)用毒理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079；3 湖北省疾病預(yù)防與控制研究中心，武漢 430079)

近年來(lái)研究報(bào)道，具有瀉下功能的以蒽醌和大黃素為主要活性成分的傳統(tǒng)中藥長(zhǎng)期使用后會(huì)有安全隱患[1-5]。黨參是我國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)益(補(bǔ)氣)中藥，具有補(bǔ)中益氣、和脾胃、生津養(yǎng)血之功效[6]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黨參具有增強(qiáng)免疫力[7]、調(diào)節(jié)保護(hù)胃腸道[8]、抗?jié)僛9]、降血糖[10]以及抗炎抗氧化等[11]生物活性，但是對(duì)黨參改善便秘的作用研究較少。

本文采用地芬諾酯灌胃造成小鼠便秘模型，考察黨參水提物對(duì)便秘小鼠小腸推進(jìn)和排便的影響，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠腸道內(nèi)五羥色胺(5-HT)和血管活性腸肽(VIP)的含量進(jìn)行測(cè)定，推測(cè)黨參輔助通便的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)和排便實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物為SPF級(jí)昆明種小鼠，來(lái)源于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，生產(chǎn)許可證號(hào)分別為SCXK(鄂)2008—0005和SCXK(鄂)2015—0018，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(鄂)2012—0065。小鼠在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為20～26℃，濕度為40%～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑[12]

含5%的活性炭粉、10%阿拉伯膠墨汁的配制方法：準(zhǔn)確稱取阿拉伯樹膠100g，加入800mL蒸餾水，加熱煮沸至溶液呈透明狀，再稱取活性碳粉末50g加入上述溶液中，繼續(xù)煮沸3次，溶液放涼后加蒸餾水定容到1 000mL，置4℃冰箱中保存，臨用前搖勻。

黨參，藥材來(lái)源同已發(fā)表文章[12]。黨參提取物制備工藝為藥材粉碎，按料液比1∶6加入純水，95～100℃水浴加熱提取2次，每次1.5h，水提液過(guò)濾，合并，濃縮凍干，最終藥材和提取物的提取比約為2.5∶1。分別取黨參水提物16 667、8 333、4 167mg，用蒸餾水溶解并定容至100mL，供小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)和排便實(shí)驗(yàn)1～7d灌胃使用；另外，分別取黨參水提物3 333、1 667、833mg，用含5%的活性炭粉、10%阿拉伯膠墨汁溶解并定容至20mL，供小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)第8天使用。

復(fù)方地芬諾酯片，廣西河豐藥業(yè)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)為 130401。分別取復(fù)方地芬諾酯片25、50mg，研缽研碎后加入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解稀釋至100mL，分別供小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃团疟銓?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪褂?，臨用前配制。

小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)中，小鼠5羥色胺(5-HT)酶聯(lián)免疫分析試劑盒批號(hào)為201411-201505，小鼠血管活性腸肽(VIP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒批號(hào)為201412-201506；所有試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1劑量與分組 小腸推進(jìn)和排便實(shí)驗(yàn)分開但同時(shí)進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均分為陰性對(duì)照組(Negative Control，灌胃給予純水)、模型對(duì)照組(Positive Control，灌胃給予復(fù)方地芬諾酯)、黨參水提物高劑量組3 333mg/kg(High Dose)、黨參水提物中劑量組1 667mg/kg (Medium Dose)、黨參水提物低劑量組833mg/kg(Low Dose)，每組動(dòng)物數(shù)量12只。每組實(shí)驗(yàn)小鼠均按0.20mL/10g BW的容量灌胃給予對(duì)應(yīng)試劑，連續(xù)灌胃7d后開始小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)或排便功能實(shí)驗(yàn)。

1.3.2小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn) 按照1.3.1分組，不同組小鼠連續(xù)灌胃7d給予不同試劑，禁食不禁水16h，(第8天)模型對(duì)照組和黨參各劑量組按5mg/kg劑量灌胃給予復(fù)方地芬諾酯溶液。30min后，黨參各劑量組分別給予等濃度的含墨汁溶液，陰性對(duì)照組和模型對(duì)照組只按照0.2mL/10g BW的容量給予墨汁灌胃。25min后，所有小鼠脫頸處死，打開腹腔小心分離腸系膜，剪取幽門(上端)至回盲部(下端)的腸管，然后置于托盤上輕輕將小腸拉成直線，直尺測(cè)量幽門括約肌至小腸回盲部墨汁推進(jìn)的長(zhǎng)度(遠(yuǎn)端)及小腸總長(zhǎng)度，計(jì)算墨汁推進(jìn)率P(%)；另外，取1cm長(zhǎng)的結(jié)腸組織，準(zhǔn)確稱重后立即置液氮凍存，用于后期5-HT和VIP含量測(cè)定。

小腸推進(jìn)功能以墨汁推進(jìn)率P(%)表示：

{[幽門到墨汁推進(jìn)遠(yuǎn)端間的距離(cm)]/[小腸全長(zhǎng)距離(cm)]} ×100%

1.3.3排便實(shí)驗(yàn) 測(cè)定首粒排黑便時(shí)間、糞便粒數(shù)和糞便重量。按1.3.1分組后，小鼠連續(xù)灌胃7d，之后禁食不禁水16h，(第8天)模型對(duì)照組和黨參各劑量組按10mg/kg劑量灌胃給予復(fù)方地芬諾酯溶液。30min后，黨參各劑量組分別給予等濃度的含墨汁溶液，陰性對(duì)照組和模型對(duì)照組只按照0.2mL/10g·BW的容量給予墨汁灌胃。完成后將小鼠進(jìn)行單籠喂養(yǎng)，恢復(fù)正常飲水進(jìn)食，開始計(jì)時(shí)，記錄每只小鼠首次排黑便時(shí)間、5h內(nèi)排黑便粒數(shù)及糞便總重量。

1.3.4腸組織中5-HT、VIP含量的測(cè)定 取液氮凍存的結(jié)腸組織在保持低溫條件下，按1∶9比例加入生理鹽水制備勻漿，離心(3 500r/min)20min，取上清液于-20℃下保存。5-HT、VIP的檢測(cè)方法及計(jì)算方法均參照上海酶聯(lián)生物科技有限公司的試劑盒說(shuō)明。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參水提物對(duì)便秘小鼠體重的影響

如表1、表2所示，兩個(gè)動(dòng)物模型中模型對(duì)照組和黨參不同劑量組小鼠的終體重與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較，結(jié)果均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明地芬諾酯和黨參水提物對(duì)模型小鼠體重?zé)o影響。

表1 小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)中各組小鼠體重

注：與陰性對(duì)照組比較，P>0.05

表2 排便實(shí)驗(yàn)中各組小鼠體重的影響

注：與陰性對(duì)照組比較，P>0.05

2.2 小鼠小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1、表3可以發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組比較，給予5mg/kg劑量地芬諾酯的模型對(duì)照組中小鼠墨汁推進(jìn)距離明顯降低(P<0.01)，表明該劑量的地芬諾酯能夠成功誘導(dǎo)小鼠小腸蠕動(dòng)抑制模型。與模型對(duì)照組比較，黨參水提物3個(gè)劑量組中小鼠平均墨汁推進(jìn)率都明顯增加，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，且推進(jìn)率同沒有給予地芬諾酯的陰性對(duì)照組接近，說(shuō)明黨參水提物能夠逆轉(zhuǎn)地芬諾酯導(dǎo)致的小鼠小腸蠕動(dòng)減緩的情況，提示其可能具有促進(jìn)小腸蠕動(dòng)的功能(圖2)。

表3 不同劑量黨參水提物對(duì)小鼠小腸推進(jìn)的影響

注：與陰性對(duì)照組比較，#P>0.01；與模型對(duì)照組比較，**P<0.01

2.3 結(jié)腸組織中5-HT、VIP含量測(cè)定

如圖3所示，與陰性對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織中的5-HT含量降低、VIP含量升高，并均有顯著性差異(均P<0.01)，模型組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[13，18]。與模型對(duì)照組比較，黨參水提物高劑量和低劑量組小鼠結(jié)腸組織中5-HT表達(dá)明顯上升，VIP表達(dá)明顯下降，其中高劑量組有非常顯著差異(P<0.01)，低劑量組有顯著性差異(P<0.05)，表明黨參水提物對(duì)小腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用可能與調(diào)節(jié)5-HT和VIP的水平有關(guān)。

2.4 小鼠排便實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與陰性對(duì)照組比較，給予10mg/kg復(fù)方地芬諾酯的模型對(duì)照組便秘小鼠首粒排黑便時(shí)間明顯延長(zhǎng)，5h內(nèi)排黑便總重量明顯減少(P<0.01)，說(shuō)明小鼠出現(xiàn)明顯便秘癥狀，提示便秘模型成立。受試組與模型對(duì)照組比較，不同劑量的黨參水提物對(duì)便秘小鼠的首粒排黑便時(shí)間、排黑便粒數(shù)以及黑便重量均有一定的改善作用，其中高劑量組能顯著縮短首粒排黑便的時(shí)間(P<0.01)，明顯增加5h內(nèi)排黑便總重量(P<0.05)；低劑量組能明顯增加便秘小鼠5h內(nèi)排黑便總重量(P<0.05)。結(jié)果提示，黨參水提物尤其是高劑量情況下對(duì)便秘小鼠的排便具有改善作用。

圖1 小鼠小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照進(jìn)行轉(zhuǎn)化，P為推進(jìn)率(%)。與陰性對(duì)照組比較，#P<0.01；與模型對(duì)照組比較，**P<0.01

圖2 黨參水提物對(duì)小鼠結(jié)腸組織中5-HT、VIP含量的影響注：與陰性對(duì)照組比較，#P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3 黨參水提物對(duì)小鼠首粒排黑便時(shí)間、排黑便粒數(shù)和黑便重量的影響注：與陰性對(duì)照組比較，#P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*P<0.05、**P<0.01

3 討論

研究表明，黨參健脾養(yǎng)胃的功能可以促進(jìn)實(shí)驗(yàn)小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)，其主要活性部位可能為黨參多糖[13-14]。本實(shí)驗(yàn)依照CFDA通便功能檢測(cè)方法考察了黨參水提物(多糖含量為10%～15%)對(duì)小腸墨汁推進(jìn)作用，并首次研究報(bào)道其對(duì)便秘小鼠排便功能的影響，考察了首粒排便時(shí)間、5 h糞便粒數(shù)和糞便總重量等指標(biāo)。結(jié)果表明，黨參水提物高、中、低(3 333～833mg/kg)3個(gè)劑量均具有小腸推進(jìn)功能，其中高劑量和低劑量黨參水提物還能夠縮短排便功能中首粒黑便時(shí)間，增加排便粒數(shù)和重量。

研究表明，5-HT是胃腸道運(yùn)動(dòng)和分泌功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)[15]。95%的5-HT來(lái)源于腸道黏膜層的嗜鉻細(xì)胞，腸黏膜嗜咯細(xì)胞釋放5-HT，能刺激腸吸收水分從而促進(jìn)腸蠕動(dòng)，參與胃腸運(yùn)動(dòng)和分泌功能。本實(shí)驗(yàn)中，復(fù)方地芬諾酯造模組5-HT含量明顯低于陰性對(duì)照組，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，黨參水提物高、中、低3個(gè)劑量組與模型組比較，實(shí)驗(yàn)小鼠腸道內(nèi)5-HT水平有上升趨勢(shì)，其中高劑量和低劑量組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01或P<0.05)，表明黨參水提物可能具有刺激腸道黏膜層的嗜鉻細(xì)胞分泌5-HT的作用，升高腸道內(nèi)5-HT的水平，進(jìn)而促進(jìn)腸蠕動(dòng)，因此黨參水提物的小腸推進(jìn)功能可能與調(diào)節(jié)腸道內(nèi)5-HT水平有關(guān)。

VIP的主要作用是增強(qiáng)胃腸粘膜的腺體分泌、松弛胃腸道平滑肌、抑制胃腸蠕動(dòng)[16-17]，與慢傳輸型便秘的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[18-19]，通過(guò)抑制胃腸道平滑肌收縮及腸肌緊張性，減少胃腸粘膜的分泌活動(dòng)，從而抑制腸蠕動(dòng)導(dǎo)致慢傳輸型便秘。李勇等[20]發(fā)現(xiàn)，VIP在復(fù)方地芬諾酯小鼠便秘模型中含量要明顯高于陰性對(duì)照組，認(rèn)為VIP含量的升高可能是便秘早期腸神經(jīng)系統(tǒng)的一種代償性反應(yīng)。本研究采用復(fù)方地芬諾酯誘導(dǎo)了小鼠便秘模型，VIP含量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組VIP含量與陰性對(duì)照組比較明顯升高了，而給予能促進(jìn)腸蠕動(dòng)、改善便秘癥狀的黨參水提物組，VIP的含量明顯下降(高劑量、低劑量黨參水提物組與模型組相比較，VIP含量顯著下降，接近于陰性對(duì)照組水平)。本實(shí)驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]，一方面說(shuō)明黨參水提物可促進(jìn)小腸運(yùn)動(dòng)和排便，另一方面也證明VIP含量升高是便秘早期長(zhǎng)神經(jīng)的一種代嘗性反應(yīng)。

4 結(jié)論

黨參水提物3個(gè)劑量組均具有明顯的小腸推進(jìn)功能，其中高劑量和低劑量能夠顯著增加5-HT水平和降低VIP水平，黨參水提物的促腸推進(jìn)作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)5-HT水平有關(guān)；排便實(shí)驗(yàn)中，高劑量黨參水提物能夠顯著改善便秘小鼠的排便功能(縮短首粒黑便時(shí)間，增加黑便總重量)，而低劑量和中劑量對(duì)排便功能的3個(gè)指標(biāo)有改善的趨勢(shì)但部分指標(biāo)無(wú)顯著性差異。結(jié)合兩個(gè)模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示黨參水提物具有潛在的通便功能。作為藥食同源來(lái)源的原料，黨參可以作為通便、改善胃腸道保健品的原料進(jìn)一步開發(fā)?！?/p>