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漫話(huà)同位素示蹤法

2018-12-20 09:34張淑銘林穎韜俞如旺
生物學(xué)教學(xué) 2018年12期
關(guān)鍵詞:計(jì)數(shù)器同位素射線(xiàn)

張淑銘 林穎韜 俞如旺,*

(1福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350117; 2福建教育學(xué)院 福州 350025)

同位素是指一類(lèi)原子核內(nèi)具有相同質(zhì)子數(shù),但中子數(shù)不同,在元素周期表中處于同一位置的核素。其中,某些核素會(huì)因其不穩(wěn)定的性質(zhì)自發(fā)衰變成新核素,同時(shí)放出一種或多種射線(xiàn),如α、β-、β+、γ、X等,這種特性稱(chēng)為放射性。具有放射性的核素稱(chēng)為放射性核素或放射性同位素,不具放射性的核素稱(chēng)為穩(wěn)定同位素。

同位素示蹤法則是一種以同位素作為示蹤物質(zhì),對(duì)研究對(duì)象的特征和行為進(jìn)行示蹤觀(guān)察的信息獲取方法,分為兩類(lèi): 放射性同位素示蹤法和穩(wěn)定同位素示蹤法。

1 同位素示蹤法的基本原理

同位素示蹤法的基本原理: 利用同位素及其化合物與相對(duì)應(yīng)普通元素及其化合物具有相同化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì),但核物理性質(zhì)不同的特點(diǎn),將同位素作為標(biāo)記物,制備成含有同位素的化合物,代替相應(yīng)非標(biāo)記化合物進(jìn)行標(biāo)記。由于放射性同位素能夠放出射線(xiàn),因此可通過(guò)射線(xiàn)的感光作用進(jìn)行放射自顯影,或利用射線(xiàn)的電離作用、熒光現(xiàn)象進(jìn)行核探測(cè)器檢測(cè)。而穩(wěn)定同位素雖不具有放射性,但其在原子質(zhì)量上與普通的相應(yīng)同位素有差別,因此可以通過(guò)質(zhì)譜儀、氣相層析儀、核磁共振儀等質(zhì)量分析儀來(lái)測(cè)定。

2 放射性同位素示蹤法的實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.1 選擇示蹤劑 根據(jù)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目需要選擇合適的示蹤劑。一般與待標(biāo)記有機(jī)物中所含的元素、放射性同位素的半衰期、射線(xiàn)種類(lèi)及輻射能量以及同位素的毒性等有關(guān)[1]: ①為了達(dá)到實(shí)驗(yàn)的理想效果,一般選用研究對(duì)象中的特征元素進(jìn)行示蹤;②根據(jù)實(shí)驗(yàn)周期,選用半衰期合適的放射性同位素,一般能保證檢測(cè)結(jié)束時(shí),放射性同位素的含量為給入量的70%為宜;③用的核素宜為純?chǔ)?、β、γ射線(xiàn)的發(fā)射體,保證射線(xiàn)能量在1.0~2.5MeV的適宜范圍內(nèi);④所選示蹤劑盡量避免高毒性。如實(shí)驗(yàn)必需,則應(yīng)控制其用量在對(duì)人體和環(huán)境無(wú)害的范圍之內(nèi)。綜上,將中學(xué)生物學(xué)探究活動(dòng)中常用的幾種放射性同位素的特征[2]整理成表1。

2.2 確定標(biāo)記方法 根據(jù)示蹤劑的性質(zhì)、形態(tài)以及研究目的和對(duì)象的不同,示蹤劑的標(biāo)記方式也有所不同。

表1 中學(xué)生物學(xué)探究活動(dòng)中涉及的放射性同位素的特征

對(duì)植物體的標(biāo)記方法有: ①“植物營(yíng)養(yǎng)室”培養(yǎng)法。在密閉的植物營(yíng)養(yǎng)室中,通入放射性氣體供植物進(jìn)行光合作用。②植物地上部引入法。將示蹤劑配制成濃度合適的溶液,通過(guò)涂抹、噴霧、注射等方法將示蹤劑從植物的地上部引入植物體內(nèi)。③植物根部引入法。即將示蹤劑加入栽培介質(zhì)如水、沙、土等,供給植物生長(zhǎng)。

對(duì)于動(dòng)物體的標(biāo)記方法有: ①注射法。即利用針管等,將示蹤劑直接注射入機(jī)體內(nèi)。②口服法。通過(guò)進(jìn)食、飲水、胃管或投丸等途徑引入。③涂布滲入法。清除動(dòng)物部分皮毛,將示蹤劑涂抹于脫毛處。④吸入法。將揮發(fā)性示蹤劑裝入密閉系統(tǒng),通過(guò)呼吸作用吸入動(dòng)物體內(nèi)。

對(duì)于微生物的標(biāo)記方法通常用含放射性物質(zhì)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)標(biāo)記。

上述三大類(lèi)標(biāo)記方法在中學(xué)生物學(xué)教材中均有涉及。例如,探究光合作用有機(jī)物生成路徑的實(shí)驗(yàn)中,卡爾文即是利用“植物營(yíng)養(yǎng)室”培養(yǎng)法,在密閉的小室中,向小球藻供以14CO2進(jìn)行光合作用;探究分泌蛋白合成與運(yùn)輸路徑的實(shí)驗(yàn)中,詹姆森等通過(guò)注射法,向豚鼠的胰腺腺泡細(xì)胞注射3H標(biāo)記的亮氨酸;探究生物體遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中,赫爾希與蔡斯則是利用含32P與35S的大腸桿菌作為活體培養(yǎng)基,實(shí)現(xiàn)對(duì)噬菌體DNA及蛋白質(zhì)外殼的標(biāo)記。

2.3 制備放射性生物樣品 不同形態(tài)的樣品,其制備方法也有所不同。植物體常用打孔法或勻漿法,如探究光合作用有機(jī)物生成路徑實(shí)驗(yàn)即是通過(guò)研磨小球藻,制備勻漿樣品。動(dòng)物體組織既可采用勻漿法,也可進(jìn)行細(xì)胞組織切片的制作,如探究分泌蛋白合成與運(yùn)輸路徑的實(shí)驗(yàn)中,采取的方法即制備豚鼠胰腺腺泡細(xì)胞的超薄切片。對(duì)于沉淀等干物質(zhì)的樣品制備,則需先將其置于70~80℃的烘箱中烘干,并用研缽研磨制取粉末,再放入烘箱烘干,之后取出干燥制成薄膜狀樣品。液體樣品一般可直接進(jìn)行測(cè)量,或利用熱風(fēng)吹、電熱板或紅外燈進(jìn)行干燥鋪樣。如在噬菌體侵染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)中,對(duì)沉淀物采取薄膜樣品制備,而上清液則利用儀器烘干進(jìn)行鋪樣檢測(cè)。

2.4 測(cè)量樣品放射性 放射性的檢測(cè)主要通過(guò)核探測(cè)器測(cè)量以及放射自顯影技術(shù)。

2.4.1 核探測(cè)器選擇依據(jù)及檢測(cè)原理 測(cè)量放射性的核探測(cè)器主要有氣體電離探測(cè)器、閃爍計(jì)數(shù)器以及半導(dǎo)體探測(cè)器3種。其中氣體電離探測(cè)器包括電離室、正比計(jì)數(shù)管以及蓋革-彌勒計(jì)數(shù)器3類(lèi)。閃爍計(jì)數(shù)器根據(jù)閃爍體的形態(tài)不同分為固體和液體閃爍計(jì)數(shù)器兩類(lèi)。

在示蹤實(shí)驗(yàn)中,核探測(cè)器的選擇與同位素放射的射線(xiàn)性質(zhì)有關(guān)。放射α射線(xiàn)的同位素,采用電離室進(jìn)行檢測(cè);放射低能β射線(xiàn)的同位素,采用正比計(jì)數(shù)管或蓋革-彌勒計(jì)數(shù)器檢測(cè);放射中能β射線(xiàn)以及高能β射線(xiàn)的同位素,采用β計(jì)數(shù)管或正比計(jì)數(shù)管檢測(cè);放射γ射線(xiàn)的同位素,則采用γ計(jì)數(shù)管或晶體閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)。中學(xué)教材中涉及到的放射性同位素,其射線(xiàn)性質(zhì)均為β射線(xiàn),其中3H、14C、35S放射的是低能β射線(xiàn),32P放射的是中能β射線(xiàn),因此檢測(cè)儀器一般選用正比計(jì)數(shù)管或蓋革-彌勒計(jì)數(shù)器。

結(jié)合教材中噬菌體侵染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn),對(duì)蓋革-彌勒計(jì)數(shù)器的結(jié)構(gòu)及工作原理進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。蓋革-彌勒計(jì)數(shù)器由高壓電源、蓋革-彌勒計(jì)數(shù)管(G-M管)以及定標(biāo)器組成。其中,高壓電源為計(jì)數(shù)管提供電壓;定標(biāo)器記錄由計(jì)數(shù)管輸出的脈沖;G-M管根據(jù)其外形可分為鐘罩型和圓柱型,內(nèi)部充有惰性氣體。

在噬菌體侵染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)中,使用的為鐘罩型計(jì)數(shù)管(圖1)。在實(shí)驗(yàn)中,分別將分離后的上清液以及沉淀物置于計(jì)數(shù)管內(nèi),由于32P以及35S衰變放射出β射線(xiàn),使管內(nèi)原有的氣體被電離形成離子對(duì)。負(fù)離子被陽(yáng)極吸引移向陽(yáng)極,在此過(guò)程中,負(fù)離子會(huì)與管內(nèi)氣體發(fā)生碰撞,產(chǎn)生次級(jí)電子,在快到達(dá)陽(yáng)極時(shí),次級(jí)電子急劇倍增,產(chǎn)生“雪崩”現(xiàn)象,形成脈沖數(shù),后經(jīng)放大由定標(biāo)器記錄。而正離子則被陰極吸引,當(dāng)移到陰極時(shí),會(huì)再次產(chǎn)生電子,從而形成下一個(gè)脈沖數(shù)。由于管內(nèi)惰性氣體會(huì)與正離子發(fā)生電荷中和,因此防止了持續(xù)放電的情況。在測(cè)量過(guò)程中,通過(guò)改變電壓,分別記錄不同電壓下的脈沖數(shù),制作計(jì)數(shù)管的特性曲線(xiàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,得出放射性強(qiáng)度。該實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果,在被35S標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)組上清液中,檢測(cè)到較高的放射性。而在被32P標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)組沉淀物中,檢測(cè)到較高的放射性,從而確定了DNA為遺傳物質(zhì)[3]。

圖1 鐘罩型計(jì)數(shù)管

2.4.2 放射自顯影技術(shù)原理 中學(xué)生物學(xué)教材中分泌蛋白合成與運(yùn)輸?shù)膶?shí)驗(yàn),即是利用該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行放射性檢測(cè)??茖W(xué)家分別在不同時(shí)間處死豚鼠,并制備其胰腺腺泡細(xì)胞的超薄切片。之后,將鹵化銀乳膠膜均勻敷于切片表面,置于暗室中曝光。由于3H衰變放射出β射線(xiàn),與鹵化銀晶體顆粒反應(yīng),使其轉(zhuǎn)變?yōu)榻饘巽y顆粒形成潛影,再經(jīng)顯影、定影后,即可用顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察。該實(shí)驗(yàn)最終使用最佳的三次顯影效果確定了分泌蛋白合成與運(yùn)輸?shù)穆窂健?/p>

3 穩(wěn)定同位素示蹤法的實(shí)驗(yàn)過(guò)程

穩(wěn)定同位素示蹤法的實(shí)驗(yàn)過(guò)程與放射性同位素示蹤法相比較為簡(jiǎn)便,其示蹤劑的選擇以及給入過(guò)程與之相同,在此不作贅述。以下簡(jiǎn)要介紹穩(wěn)定同位素示蹤過(guò)程中樣品的制備以及測(cè)量的方法。

3.1 制備生物樣品 常見(jiàn)的樣品制備方法有: ①含N同位素樣品的制備,利用凱氏法或杜氏法將含氮有機(jī)生物樣品轉(zhuǎn)化為分子態(tài)的氮(N2);②含C同位素樣品的制備,通過(guò)燃燒法將碳轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的CO2;③含O同位素樣品的制備,利用不含氧的催化劑在高溫條件下使有機(jī)物轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的CO2。

盡管同位素示蹤法應(yīng)用廣泛,但仍存在局限性,并不能解決所有的問(wèn)題,往往需配合其他技術(shù)才能發(fā)揮作用。在中學(xué)教材中,探究DNA復(fù)制方式的實(shí)驗(yàn),即是將穩(wěn)定同位素示蹤法與平衡密度梯度離心技術(shù)相結(jié)合。將含有14N和15N標(biāo)記的大腸桿菌培養(yǎng)液,在濃縮的CsCl溶液中進(jìn)行高速密度梯度離心。在離心的過(guò)程中,DNA由于受到離心力場(chǎng)的作用,聚集到溶液密度等于其自身浮力密度的區(qū)域。因子代DNA含有不同N標(biāo)記的亞基,其密度也就不同,致使結(jié)果出現(xiàn)不同位置的條帶,進(jìn)而可通過(guò)紫外照相及紫外掃描確定條帶位置。最終結(jié)果表明,DNA的復(fù)制方式為半保留復(fù)制,即每個(gè)子代只得到親代的一個(gè)亞基且世代穩(wěn)定遺傳[5]。

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