丁 惠，紀(jì)文華，賀吉香*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355；2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250014)

熒光增白劑(FWAs)是一種具有復(fù)雜化學(xué)結(jié)構(gòu)的熒光染料，由于其在吸收不可見紫外光(290～400nm)的同時可以發(fā)射比入射光范圍更廣的可見光(400～480nm)，所以能夠提高基質(zhì)的白度和亮度[1]。當(dāng)前，F(xiàn)WAs被廣泛應(yīng)用于造紙、洗滌劑、塑料、紡織纖維等產(chǎn)品中，以達(dá)到增白增艷的效果[2]。為追求經(jīng)濟利益，一些不法商家將FWAs添加到食品及其包裝材料中以提高產(chǎn)品的外觀，吸引消費者。FWAs在人體內(nèi)會與人血清蛋白結(jié)合，進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，而FWAs特殊的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其難以通過新陳代謝正常排出體外，從而在體內(nèi)蓄積危及人類健康[3]。此外，F(xiàn)WAs會阻礙傷口愈合，且一旦在體內(nèi)蓄積過量，將成為潛在的致癌因素[4]。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T27741-2011和GB31604.47-2016中規(guī)定了紙制品和食品接觸材料中相關(guān)FWAs的檢測方法及檢出限，衛(wèi)生部《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單(第四批)》明確指出面粉中的熒光增白劑為違法添加的非食用物質(zhì)。因此迫切需要建立一種高效便捷的食品中FWAs的檢測方法。目前，F(xiàn)WAs的檢測方法主要有熒光分光光度法[5]、紫外分光光度法[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7]以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[8-9]。鑒于樣品基質(zhì)復(fù)雜，成分多樣，且基質(zhì)中FWAs的添加水平較低，因此選擇合適的前處理方法實現(xiàn)對目標(biāo)分析物的有效富集十分重要。

固相萃取(SPE)作為目前廣泛應(yīng)用的一種樣品前處理方法，在食品檢測[10]、環(huán)境監(jiān)測[11]、生物樣品分析[12]等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。SPE能有效避免大量有機溶劑的使用，同時具有基質(zhì)效應(yīng)小、操作方便等優(yōu)點，可在短時間內(nèi)實現(xiàn)對目標(biāo)分子的快速富集[13-15]。除了傳統(tǒng)的C18、硅膠、氧化鋁和氨基等固相萃取填料外，金屬有機框架材料、氧化石墨烯、碳納米管等新興材料由于具有良好的吸附性能和較高的穩(wěn)定性而得到廣泛關(guān)注[16-19]。本文選擇三氯化鉍作為催化劑，使2,4,6-三羥基-1,3,5-苯三甲醛和2,6-二氨基吡啶在低溫下聚合成一種具有良好吸附性能的共價有機多孔聚合物(COPs)。將COPs成功應(yīng)用于固相萃取填料，基于此建立了熒光增白劑的高效液相色譜檢測方法，該方法具有較好的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性，能夠用于實際樣品的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

傅立葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet儀器公司);JW-BK132F型比表面積測定儀(北京精微高博科學(xué)技術(shù)有限公司);固相萃取裝置(美國Supelco公司);Waters e2695高效液相色譜儀，配2998二極管陣列檢測器及Empower3色譜工作站(美國Waters公司);超純水由Milli-Q系統(tǒng)制得(美國Millipore公司)。

圖1 3種熒光增白劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of three FWAs

1.2 COPs的制備

在50mL圓底燒瓶中加入0.63g TFP和0.22g2,6-DAP，加入14mL1,3,5-三甲基苯和二氧六環(huán)(6∶1，體積比)的混合溶劑，再加入0.013g BiCl3，超聲10min后密封，置于室溫下聚合反應(yīng)8h。離心除去上清液，所得反應(yīng)產(chǎn)物用濾紙包裹置于索氏提取器中，以甲醇-三氟乙酸(9∶1，體積比)回流24h除去未反應(yīng)的原料，再用甲醇洗至中性，真空干燥24h。研磨后得到褐色產(chǎn)物，避光保存。

1.3 等溫吸附實驗

稱取10mg COPs加至10mL螺口玻璃瓶中，然后加入2.5mL系列質(zhì)量濃度的3種FWAs標(biāo)準(zhǔn)溶液(1～60mg·L-1)，室溫振蕩120min后，離心去除聚合物，上清液過0.45μm濾膜并采用HPLC測定。聚合物的平衡吸附量(Qe,mg·g-1)由下式計算得到：Qe=(Ci-Ce)V/m，其中，Ci(g·L-1)和Ce(g·L-1)分別為FWAs的初始質(zhì)量濃度和吸附達(dá)平衡時的質(zhì)量濃度；V(mL)為標(biāo)準(zhǔn)溶液體積；m(mg)為聚合物的質(zhì)量。

1.4 吸附動力學(xué)實驗

將10mg COPs加至10mL螺口玻璃瓶中，然后加入2.5mL50mg·L-1的FWAs標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫下振蕩3～80min，離心后取上清液，過0.45μm濾膜并采用HPLC測定，以考察聚合物對目標(biāo)分析物的傳質(zhì)速率。

1.5 液相色譜條件

色譜柱：Symmetry?C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測波長：370nm；流速：1.0mL·min-1；流動相：A為甲醇，B為0.1%三氟乙酸水溶液，梯度洗脫程序：0～4min，94% A；4～5min，94%～91% A；5～16min，91%A。

1.6 實際樣品的制備

實驗用面粉均購自濟南當(dāng)?shù)爻?、市場和糧油店。精密稱取1.0000g樣品于100mL錐形瓶中，以50mL 氯仿超聲提取30min，離心后，取上清液用氯仿定容至50mL，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 COPs的制備

相較于傳統(tǒng)的高溫聚合方法，本實驗借鑒Matsumoto等[20]的研究，采用低溫聚合的方法使單體快速聚合?？疾炝嗽系牟煌浔葘酆衔镂饺萘?Qe)的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)TFP和2,6-DAP的摩爾比為3∶2時，Qe達(dá)最大值(0.28mg·g-1)，隨著原料中2,6-DAP的增多，Qe有所下降。同時評價了另外3種催化劑(Sc(OTf)3、InCl3.4H2O、TsOH)所制聚合物的吸附能力，得到其Qe分別為0.11、0.14、0.06mg·g-1，均低于BiCl3催化下形成的COPs對目標(biāo)分析物的吸附容量(0.28mg·g-1)，因此實驗最終選擇BiCl3作為合成COPs的催化劑。

2.2 COPs的性能表征

2.2.1比表面積根據(jù)BET氮氣吸附等溫線評價COPs的物理特性，測得COPs的比表面積為271 m2·g-1，相應(yīng)的孔穴體積為0.120 m3·g-1，表明COPs具有多孔性，從而具有較大的吸附容量。根據(jù)IUPAC分類，COPs的N2吸附等溫線的形狀可歸屬于Ⅳ型等溫線，推斷聚合物為介孔類吸附劑材料。

圖2 COPs的紅外光譜Fig.2 FT-IR spectra of COPs

2.3 等溫吸附實驗

利用等溫吸附實驗測定COPs對FWA 367、FWA 368和FWA 393的吸附量(圖3A)，結(jié)果顯示，COPs的吸附量隨著FWAs質(zhì)量濃度的增大而增加。當(dāng)FWA 368、FWA 367和FWA 393的初始質(zhì)量濃度分別超過40、30、30 mg·L-1時，COPs對目標(biāo)化合物的平衡吸附量不再變化，此時達(dá)到飽和吸附容量。

選擇Freundlich和Langmuir吸附模型評估COPs對3種FWAs的吸附性能，結(jié)果見表1，KF和KL分別為兩方程的平衡常數(shù)，n為吸附強度，Qm為理論最大吸附量。根據(jù)計算結(jié)果可知，F(xiàn)reundlich吸附模型與數(shù)據(jù)的擬合關(guān)系更好(r2≥0.921)；n>1，表明COPs對FWAs的吸附存在多種不同的結(jié)合位點，具有良好的吸附性能。

表1 COPs吸附FWAs的Freundlich和Langmuir吸附模型Table 1 Freundlich adsorption models and Langmuir isotherm models for FWAs onto COPs

*ydenotes lgQe，xdenotes lgCe;**ydenotesCe/Qe,xdenotesQe

2.4 吸附動力學(xué)實驗

計算不同時間內(nèi)聚合物對50 mg·L-1FWA 367、FWA 368和FWA 393的吸附容量，可得到COPs對FWAs的動態(tài)吸附曲線(圖3B)，COPs對3種FWAs具有較高的傳質(zhì)速率，F(xiàn)WA 367、FWA 368和FWA 393分別在30、40、35 min達(dá)到最大吸附量。

吸附動力學(xué)數(shù)據(jù)分別用Lagergren準(zhǔn)一級動力學(xué)模型和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型進(jìn)行擬合分析(表2)，其中k1和k2分別為兩方程的吸附速率常數(shù)，Qe分別由實驗和擬合方程得出。由表2可知，準(zhǔn)一級動力學(xué)模型的擬合相關(guān)系數(shù)(r2≥0.868)相對較高，且由準(zhǔn)一級動力學(xué)模型得到的平衡吸附量與實驗值更為接近，故準(zhǔn)一級動力學(xué)模型更適用于本實驗的動力學(xué)數(shù)據(jù)分析。

表2 COPs吸附FWAs的準(zhǔn)一級動力學(xué)模型和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型Table 2 Pseudo-first order kinetic model and pseudo-second order kinetic model for FWAs onto COPs

2.5 固相萃取(SPE)條件的優(yōu)化

通過3種熒光增白劑在氯仿、乙酸乙酯、丙酮、四氫呋喃、甲醇、乙腈等不同有機溶劑中的溶解性實驗發(fā)現(xiàn)，氯仿可以較好地溶解FWA 367、FWA 368和FWA 393，因此選用氯仿作為樣品萃取溶劑及SPE上樣溶劑。

2.5.1吸附劑的用量將40～150 mg聚合物分別裝填到1 mL的固相萃取小柱中，考察不同吸附劑用量對3種熒光增白劑的吸附效果。結(jié)果顯示，當(dāng)吸附劑用量為100 mg時，F(xiàn)WA 367、FWA 368和FWA 393的回收率分別為97.2%、98.4%和94.1%。當(dāng)吸附劑用量小于100 mg時，回收率降至90%以下；而當(dāng)吸附劑用量高于100 mg時，上樣流速降低，分析時間延長。因此實驗確定吸附劑的最佳用量為100 mg。

2.5.2流速的優(yōu)化實驗表明，當(dāng)上樣流速為1～5 mL·min-1時，3種熒光增白劑的回收率均大于90%；當(dāng)流速增至6 mL·min-1時，F(xiàn)WA 367、FWA 368和FWA 393的回收率分別降至72.3%、81.5%和76.7%。綜合考慮分析時間和回收率，最終確定流速為5 mL·min-1。

2.5.3洗脫劑的優(yōu)化分別選用甲醇-三氟乙酸(9∶1)、氯仿-甲醇-三氟乙酸(6∶3∶1)和氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)作為洗脫劑，考察了不同體積比的洗脫劑對FWAs的洗脫能力，同時考察了不同體積(1～9 mL)的洗脫劑對目標(biāo)化合物回收率的影響。結(jié)果表明，以5 mL的氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)為洗脫劑時，F(xiàn)WA 367、FWA 368和FWA 393的回收率分別為98.2%、101%和98.7%，因此實驗選用5 mL的氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)作為洗脫劑。

2.6 方法學(xué)驗證

將3種FWAs標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為1、10、20、30、40、60、70、80、90、100 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最優(yōu)固相萃取條件下，洗脫液經(jīng)HPLC依次測定，3種FWAs在1～100 μg·L-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r2≥0.996 2)。以3倍信噪比(S/N=3)時的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限(LOD)，S/N=10時的質(zhì)量濃度為定量下限(LOQ)，得到3種FWAs的LOD為0.15～0.27 μg·kg-1，LOQ為0.50～0.89 μg·kg-1(見表3)，表明該方法具有較高的檢測靈敏度。

表3 3種FWAs的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Linear relationships,detection limits,quantitation limits，recoveries and RSDs of three FWAs

對陰性面粉基質(zhì)進(jìn)行3種不同水平(10、30、60 μg·kg-1)FWAs標(biāo)準(zhǔn)溶液的加標(biāo)回收實驗(n=6)，由表3可知，樣品經(jīng)SPE富集后，3種FWAs的回收率為81.2%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)為4.3%～12.7%。

相比于其他文獻(xiàn)方法(表4)，本方法具有較低的檢出限和定量下限，同時樣品前處理方法簡單，有機溶劑用量少，具有相對較高的回收率，結(jié)果準(zhǔn)確，能夠?qū)崿F(xiàn)面粉中熒光增白劑的定性定量檢測。

表4 樣品中熒光增白劑的檢測方法比較Table 4 Comparison of the proposed method with other methods for the determination of FWAs in samples

2.7 與商用SPE填料的比較

對比了C18、硅膠(Silica)、硅酸鎂(Florisil)和中性氧化鋁(Alumina N)為吸附填料的商用SPE柱和COPs固相萃取對3種FWAs的吸附能力。圖4A為上述5種SPE填料在首次使用時對3種FWAs的回收率，其中COPs對FWAs的回收率高達(dá)98.8%，明顯優(yōu)于其他吸附材料。同時，以3種FWAs的平均回收率為響應(yīng)值，對比了上述SPE柱經(jīng)吸附-解吸附循環(huán)使用后的吸附能力(圖4B)。結(jié)果顯示，以COPs為填料的SPE柱經(jīng)12次循環(huán)使用后，回收率仍高達(dá)87.8%，而其他幾種填料的回收率已降至60%以下，無法滿足分析檢測的要求。

2.8 實際樣品的應(yīng)用

將COPs作為吸附劑，以優(yōu)化后的SPE條件對面粉中的FWAs進(jìn)行富集，取100 mg的COPs裝填到SPE小柱中，經(jīng)3 mL甲醇和2 mL氯仿活化后，將樣品溶液以5 mL·min-1通過SPE小柱，然后用5 mL氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)洗脫，洗脫速度為1 mL·min-1，洗脫液用氯仿定容至5 mL后按本方法進(jìn)行檢測。從超市、市場和糧油店隨機購買10批面粉，經(jīng)上述最優(yōu)條件處理后進(jìn)行檢測，在2份面粉樣品中檢出FWA 393，含量分別為14.2、11.3 μg·kg-1，表明樣品包裝材料中的熒光增白劑發(fā)生遷移或不法商家違法添加了熒光增白劑。

3 結(jié) 論

本文以TFP和2,6-DAP為單體，BiCl3為催化劑，采用低溫聚合法成功制得具有良好吸附性能的共價有機多孔聚合物。通過BET等溫吸附實驗，發(fā)現(xiàn)該聚合物具有較大的比表面積和孔穴體積，能夠用于SPE填料。以COPs吸附劑為填料，建立了熒光增白劑的SPE/HPLC分析技術(shù)，方法操作簡單，重現(xiàn)性好，可實現(xiàn)熒光增白劑的快速富集，并成功應(yīng)用于面粉中3種熒光增白劑的高靈敏檢測。