賴(lài)燕華，盧浥良，李煥威，王 予，林寶敏，林 云，劉 熙

(廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，廣東 廣州 510385)

卷煙產(chǎn)品是煙絲與卷煙輔材的集成產(chǎn)品，由于卷煙葉組配方、香精香料和加工工藝的不同導(dǎo)致卷煙煙絲具有更大的復(fù)雜性和多變性，所以對(duì)不同品牌卷煙的煙絲進(jìn)行鑒別具有較大難度。隨著市場(chǎng)對(duì)卷煙產(chǎn)品需求的不斷提升，優(yōu)質(zhì)煙葉種植量和市場(chǎng)需求量的矛盾日益突出，在不斷加大原料葉組中薄片和梗絲調(diào)配比例的情況下，卷煙特有的香味風(fēng)格特征也被削弱。在此情況下，利用現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)卷煙產(chǎn)品進(jìn)行深入分析，探究不同品牌卷煙煙絲的關(guān)鍵性化學(xué)成分含量分布對(duì)于品牌卷煙的維護(hù)具有重要意義。

硅烷化氣相色譜法的原理是通過(guò)硅烷化衍生反應(yīng)使三甲基硅烷基取代衍生對(duì)象的羥基、羧基、巰基、氨基及亞氨基的活潑氫，提高衍生對(duì)象的揮發(fā)性，將非揮發(fā)性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性衍生物，可克服氣相色譜對(duì)極性強(qiáng)、揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)不能直接進(jìn)樣分析的缺點(diǎn)[1]，從而擴(kuò)大氣相色譜的測(cè)定范圍。煙草中含有羥基、羧基、巰基、氨基及亞氨基的化合物有醇類(lèi)、有機(jī)酸、糖類(lèi)、氨基酸等物質(zhì)，其對(duì)煙草和卷煙的質(zhì)量有重要影響。其中煙草中的有機(jī)酸占煙葉干物質(zhì)總量的12%～16%[2],許多有機(jī)酸及其衍生物是煙草香味的重要成分，直接影響煙葉及其制品的質(zhì)量。葡萄糖、果糖等糖類(lèi)物質(zhì)是煙草及煙草料液中的重要成分，在煙草制品中起黏合、加料、加香、產(chǎn)酸以及保潤(rùn)等作用[3]。丙二醇、丙三醇等多元醇類(lèi)化合物能夠保持煙草水分，可避免卷煙在保存過(guò)程中水分揮發(fā)造成的口感下降，減少加工過(guò)程中的糙碎，作為常用的保潤(rùn)劑在煙草中得到廣泛應(yīng)用[4-5]。氨基酸也是煙草中的一類(lèi)重要化合物，對(duì)煙葉的香味品質(zhì)有重要貢獻(xiàn)。在煙草調(diào)制、醇化或發(fā)酵加工直至燃燒過(guò)程中，游離氨基酸與還原糖(或羰基化合物)之間發(fā)生酶催化及非酶催化的棕色化反應(yīng)，生成多種具有烤香或爆米花香味特征的雜環(huán)類(lèi)化合物[6]。因此，利用煙絲硅烷化成分對(duì)不同品牌卷煙煙絲進(jìn)行鑒別具有可行性。

對(duì)于煙草中有機(jī)酸、糖類(lèi)物質(zhì)、氨基酸及丙二醇、丙三醇等保潤(rùn)劑成分的分析有多種檢測(cè)方法[7-12]，上述成分在不同卷煙中的含量差異及對(duì)感官質(zhì)量影響方面的研究也有一定進(jìn)展。賴(lài)燕華等[13]采用逐步回歸分析法建立了卷煙感官風(fēng)格品質(zhì)與有機(jī)酸之間的關(guān)系模型，發(fā)現(xiàn)異戊酸、丙二酸、苯乙酸和檸檬酸等有機(jī)酸對(duì)卷煙香韻表現(xiàn)或感官品質(zhì)存在不同影響。甘學(xué)文等[14]以果糖和苯丙氨酸為原料制備中間體，研究了其在卷煙燃燒過(guò)程中卷煙香氣成分及含量的變化情況，證實(shí)了果糖-苯丙氨酸中間體具有增強(qiáng)卷煙香氣的作用。殷延齊等[15]對(duì)15種品牌卷煙煙絲中的游離態(tài)氨基酸含量進(jìn)行了主成分分析和聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)各種氨基酸的含量分布特征能反映不同品牌卷煙的特性。朱保昆等[16]的研究表明甘油、丙二醇等保潤(rùn)劑對(duì)卷煙產(chǎn)品的感官舒適度有顯著影響。但利用煙絲硅烷化成分鑒別成品卷煙煙絲的報(bào)道較少。

本文采用硅烷化氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)指紋圖譜方法同時(shí)測(cè)定卷煙煙絲中的多種有機(jī)酸、糖類(lèi)物質(zhì)、氨基酸及丙二醇、丙三醇等成分，并根據(jù)化學(xué)模式識(shí)別原理，采用聚類(lèi)分析和主成分分析法對(duì)各種卷煙進(jìn)行了分類(lèi)和比較，探索了利用煙絲硅烷化成分對(duì)卷煙品牌進(jìn)行表征和區(qū)別的可能性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent6890/5973GC-MS聯(lián)用儀、DB-5MS色譜柱(60m×0.25mm×0.25μm)、Agilent7683自動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)Agilent公司)。

N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，美國(guó)Regis Technologies 公司)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF，德國(guó)CNW Technologies GmbH)；乙酸苯乙酯-D3(內(nèi)標(biāo)，純度98%，加拿大CDN isotopes公司)；2-硫代巴比妥酸(純度≥98.0%)，正十七烷(內(nèi)標(biāo))、磷酸、焦谷氨酸、甘油酸(純度均≥99.0%)，1,2-丙二醇、甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖、蘋(píng)果酸、檸檬酸、脯氨酸(純度均≥99.5%)，購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甘油酸鈣鹽、L-蘇阿糖酸半鈣鹽(純度99%，Aldrich公司)。

選取不同廠家3個(gè)牌號(hào)的市售烤煙型商品卷煙，共21個(gè)樣品，其中品牌A卷煙9個(gè)(樣品編號(hào)1～9)，品牌B卷煙6個(gè)(樣品編號(hào)10～15)，品牌C卷煙6個(gè)(樣品編號(hào)16～21)。

1.2 溶液的配制

內(nèi)標(biāo)溶液IS1:稱(chēng)取500mg 乙酸苯乙酯-D3，置于50mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度。

內(nèi)標(biāo)溶液IS2:稱(chēng)取1500mg 十七烷，置于50mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度。

提取溶液:準(zhǔn)確移取2.0mL IS1內(nèi)標(biāo)溶液和2.0mL IS2內(nèi)標(biāo)溶液至100mL容量瓶中，用DMF和BSTFA溶液(體積比2∶8)稀釋至刻度，得提取衍生溶液。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱(chēng)量約80mg1,2-丙二醇、96mg脯氨酸、30mg甘油、450mg蘋(píng)果酸、80mg 檸檬酸、90mg肌醇、1800mg 果糖、1800mg葡萄糖和250mg蔗糖，置于100mL棕色容量瓶中，加入超純水溶解并稀釋至刻度，得混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

取10、25、50、100、200、500μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別置于2mL色譜瓶中，用氮吹儀于室溫下吹干，再加1mL提取衍生溶液，于70℃烘箱中衍生化反應(yīng)30min，得到GC-MS分析標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 GC-MS條件

進(jìn)樣口溫度:250℃；進(jìn)樣量:1μL；分流進(jìn)樣，分流比:30∶1；載氣:氦氣，恒流模式，流量1mL/min；程序升溫:初始溫度50℃，保持2min，以5℃/min升至110℃，保持2min，再以2℃/min升至190℃，保持15min，最后以20℃/min升至280℃，運(yùn)行15min。電離方式:EI；離子源溫度:230℃；傳輸線(xiàn)溫度:280℃；掃描方式:全掃描(SCAN)和選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)，SCAN范圍為35～1000。

1.5 樣品處理

按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法YC/T31[16]將卷煙樣品制備成煙末，準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg煙末，置于2mL色譜瓶中，加入1mL提取衍生溶液，于70℃烘箱中進(jìn)行提取和衍生化反應(yīng)30min，冷卻至室溫后，取上層清液，用0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至2mL干凈色譜瓶中，得到GC-MS分析樣品溶液。以各化合物的量與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物量的比值為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物定量離子色譜峰的面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙絲的硅烷化GC-MS指紋圖譜

按照“1.1～1.5”實(shí)驗(yàn)方法，得到了21個(gè)卷煙樣品的硅烷化GC-MS指紋圖譜，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索及標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比對(duì)，共定性14種硅烷化化學(xué)成分(表1)，主要包括氨基酸、有機(jī)酸/無(wú)機(jī)酸、糖和多元醇。實(shí)驗(yàn)考察了DMF與衍生化試劑的比例、衍生化反應(yīng)溫度及時(shí)間的影響，確定DMF與BSTFA的比例為2∶8,衍生化反應(yīng)溫度和時(shí)間分別為70℃和30min，此時(shí)14種目標(biāo)化合物的衍生化效果好且趨于穩(wěn)定。3個(gè)不同品牌卷煙煙絲硅烷化衍生物的GC-MS指紋圖譜見(jiàn)圖1。

表1 卷煙煙絲的硅烷化化學(xué)成分信息Table 1 Information of the silanized chemical components in cigarette samples

*quantitative ion

由圖1可知，脯氨酸、蘇阿糖酸、葡萄糖的硅烷化衍生物均出現(xiàn)2個(gè)峰，而果糖的硅烷化衍生物出現(xiàn)3個(gè)峰。改變衍生化試劑的比例、衍生化溫度及時(shí)間，脯氨酸、蘇阿糖酸、葡萄糖和果糖的硅烷化衍生物仍出現(xiàn)2個(gè)或3個(gè)峰，說(shuō)明并非衍生化不完全所致，而是由于這些物質(zhì)存在多個(gè)異構(gòu)體，與BSTFA發(fā)生衍生化反應(yīng)后，不同異構(gòu)體的衍生化產(chǎn)物在該色譜條件下實(shí)現(xiàn)了分離[7]。另外，每個(gè)樣品的氣相色譜-質(zhì)譜分析時(shí)間達(dá)90 min，分析時(shí)間較長(zhǎng)，且果糖、葡萄糖、蔗糖等出峰較晚的化合物含量較高，1,2-丙二醇、甘油、脯氨酸、磷酸等出峰較早的化合物含量相對(duì)較低。因此，綜合考慮保留時(shí)間和含量等因素，確定以乙酸苯乙酯-D3和正十七烷為雙內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。由圖1可知，乙酸苯乙酯-D3和正十七烷與14種煙絲硅烷化成分實(shí)現(xiàn)了良好的色譜分離。由于內(nèi)標(biāo)物乙酸苯乙酯-D3的出峰位置和強(qiáng)度與1，2-丙二醇、脯氨酸、磷酸、甘油、甘油酸、蘋(píng)果酸、焦谷氨酸和蘇阿糖酸比較接近，因此可用于這些化合物含量計(jì)算；而正十七烷則用作果糖、檸檬酸、2-硫代巴比妥酸、葡萄糖、肌糖和蔗糖的內(nèi)標(biāo)物。14種目標(biāo)化合物在3個(gè)品牌中均有檢出，其中果糖(峰13、14和15)和葡萄糖(峰18和19)在3個(gè)品牌中的含量差異較大，品牌A的糖類(lèi)含量明顯較低，僅通過(guò)指紋圖譜的直觀比較，很難判斷不同品牌煙絲的歸屬，因此需對(duì)指紋圖譜數(shù)據(jù)做進(jìn)一步分析。

圖1 品牌A(A)、B(B)和 C( C)卷煙的煙絲硅烷化衍生物GC-MS指紋圖譜Fig.1 GC-MS fingerprint of silanizing derivatives in cut tobacco of cigarette brands A(A),B(B) and C(C)1.1,2-propylene glycol(1，2-丙二醇)；2，6.proline(脯氨酸)；3.phenethyl acetate-D3(乙酸苯乙酯-D3,IS1)；4.phosphoric acid(磷酸)；5.glycerol(甘油)；7.glyceric acid(甘油酸)；8.malic acid(蘋(píng)果酸)；9.pyroglutamic acid(焦谷氨酸)；10，11.threonic acid(蘇阿糖酸)；12.heptadecane(十七烷,IS2)；13，14，15.fructose(果糖)；16.citric acid(檸檬酸)；17.2-thiobarbituric acid(2-硫代巴比妥酸)；18，19.glucose(葡萄糖)；20.inositol(肌糖)；21.sucrose(蔗糖)

應(yīng)用本方法對(duì)1號(hào)卷煙樣品進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試，按照“1.5”樣品處理方法和“1.4”GC-MS條件平行測(cè)定5次，計(jì)算方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表1。14種化合物測(cè)定結(jié)果的RSD為1.5%～7.6%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.2 不同品牌煙絲硅烷化成分的含量分布

運(yùn)用箱線(xiàn)圖對(duì)3個(gè)品牌卷煙的煙絲硅烷化成分含量進(jìn)行比較，圖2列出了部分硅烷化成分的箱線(xiàn)圖。14種煙絲硅烷化成分的分布情況如下:

①卷煙品牌B的煙絲脯氨酸含量上、下四分位跨度較大，其含量范圍較寬，但卷煙品牌A、B的脯氨酸含量總體上明顯低于品牌C；②卷煙品牌C的煙絲焦谷氨酸含量上、下四分位跨度較大，含量范圍較寬，但總體上其煙絲焦谷氨酸含量低于品牌A、B；③3個(gè)品牌的煙絲磷酸含量上、下四分位均較為集中，總體上品牌B的磷酸含量大于品牌A、C；④甘油酸、蘋(píng)果酸、蘇阿糖酸、檸檬酸、果糖、葡萄糖、肌糖的含量呈現(xiàn)品牌A<品牌B<品牌C的趨勢(shì)；⑤品牌C煙絲2-硫代巴比妥酸的含量跨度較大，總體上品牌A的煙絲2-硫代巴比妥酸含量低于其他兩個(gè)品牌；⑥卷煙C的煙絲蔗糖含量明顯高于其他兩個(gè)品牌；⑦1,2-丙二醇和甘油含量在3個(gè)品牌間無(wú)明顯差異。

2.3 煙絲硅烷化成分對(duì)不同品牌卷煙的區(qū)分能力

箱線(xiàn)圖可以大致判斷硅烷化成分在3個(gè)品牌煙絲中的分布，但無(wú)法明確區(qū)分不同品牌卷煙。為明確21個(gè)樣品間的相似性和差異性，對(duì)其硅烷化成分含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用聚類(lèi)分析法和主成分分析法進(jìn)行分析，結(jié)果分別如圖3、4所示。

由圖3可知，當(dāng)距離為1.0時(shí)，樣品分為兩類(lèi)，品牌A卷煙(樣品1～9號(hào))獨(dú)自聚成一類(lèi)，距其他兩個(gè)卷煙較遠(yuǎn)，實(shí)現(xiàn)了很好的區(qū)分。品牌B卷煙(樣品10～15號(hào))和品牌C卷煙(樣品16～21號(hào))距離相對(duì)較近，但在距離約0.6處相互區(qū)分開(kāi)，各自聚為一類(lèi)。聚類(lèi)分析的結(jié)果表明，煙絲硅烷化成分可以很好地區(qū)分不同品牌卷煙。

21個(gè)樣品的主成分分析結(jié)果表明，前2個(gè)主成分因子的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為82%，其中第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的方差貢獻(xiàn)率分別為68%和14%，因此提取前2個(gè)主成分概括煙絲硅烷化的總信息量，對(duì)樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。由圖4可知，21個(gè)樣品在第一主成分和第二主成分構(gòu)成的空間內(nèi)聚為3類(lèi):樣品1～9聚成第1類(lèi)，樣品10～15聚成第2類(lèi)，樣品16～21聚成第3類(lèi)，3個(gè)品牌各自很好地區(qū)分，表明相同品牌的卷煙存在較好的相似性，而不同品牌卷煙的硅烷化成分存在較大差異，與聚類(lèi)分析的結(jié)果一致。

圖3 煙絲硅烷化成分的聚類(lèi)分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis result of different cigarette brands based on the silanized chemical components in cut tobacco

圖4 不同品牌卷煙煙絲硅烷化成分的主成分分析雙圖Fig.4 Principle component analysis bi-plot of different cigarette brands based on the silanized chemical components in cut tobacco

3類(lèi)樣品在PC1上的得分也呈現(xiàn)明顯趨勢(shì):卷煙品牌A<卷煙品牌B<卷煙品牌C。結(jié)合14種硅烷化成分在第一主成分上的載荷，由圖4可以看出:葡萄糖、甘油酸、果糖、肌糖、蘋(píng)果酸、蘇阿糖酸、蔗糖、檸檬酸在第一主成分上的載荷最大，其次為脯氨酸、磷酸、2-硫代巴比妥酸，焦谷氨酸在第一主成分上的載荷最小，表明品牌C卷煙煙絲中葡萄糖、甘油酸、果糖、肌糖、蘋(píng)果酸、蘇阿糖酸、蔗糖、檸檬酸的含量最高，品牌A卷煙煙絲中焦谷氨酸的含量最高，品牌B介于兩者之間，與箱線(xiàn)圖的分析結(jié)果基本一致。

因此可將3個(gè)品牌卷煙的煙絲硅烷化成分主要特征概括為:①品牌A除了焦谷氨酸含量較高外，糖類(lèi)成分(葡萄糖、果糖、蔗糖、肌糖)、酸類(lèi)成分(甘油酸、蘋(píng)果酸、蘇阿糖酸、檸檬酸、2-硫代巴比妥酸、磷酸)和脯氨酸含量均低于其他兩品牌；②品牌C卷煙煙絲的糖類(lèi)成分(葡萄糖、果糖、蔗糖、肌糖)、酸類(lèi)成分(甘油酸、蘋(píng)果酸、蘇阿糖酸、檸檬酸)及脯氨酸含量最高；③品牌B卷煙煙絲中糖、有機(jī)酸、氨基酸的含量介于品牌A、C之間；④3個(gè)品牌卷煙煙絲中的保潤(rùn)劑成分(1,2-丙二醇和甘油)含量無(wú)明顯差別。

聚類(lèi)分析和主成分分析的結(jié)果表明，煙絲硅烷化成分可以很好地區(qū)分不同品牌卷煙。3個(gè)卷煙品牌的硅烷化成分差異主要在于糖和酸含量的不同，而糖和酸均是卷煙料液中常用的原料，其種類(lèi)的選擇、用量及協(xié)調(diào)性對(duì)料液的處理效果具有重要影響[17]。相同品牌聚成一類(lèi)，可能是由于同一品牌廠家的煙葉庫(kù)存結(jié)構(gòu)相同，加之主流料液的應(yīng)用，使得相同品牌產(chǎn)品煙絲糖、酸成分的含量及比例整體上具有相似性，導(dǎo)致同一品牌樣品在聚類(lèi)圖及主成分分析圖中聚成一團(tuán)。反之，不同品牌卷煙由于各廠家的葉組配方和添加料液存在較大差異，因此煙絲中糖、酸的成分含量和比例差異大，使不同品牌卷煙可以很好地相互區(qū)分開(kāi)。

3 結(jié) 論

本文運(yùn)用硅烷化衍生化法對(duì)卷煙煙絲樣品中的主要化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，得到了21個(gè)樣品的硅烷化GC-MS指紋圖譜，并通過(guò)箱線(xiàn)圖、聚類(lèi)分析及主成分分析對(duì)實(shí)驗(yàn)得到的煙絲硅烷化成分含量進(jìn)行了處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)21個(gè)樣品被分成3類(lèi)，相同品牌聚成一類(lèi)，而不同品牌卷煙樣品在聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖和主成分分析得分圖中均能很好地相互區(qū)分，說(shuō)明不同品牌卷煙的硅烷化成分存在較大的差異，表明煙絲硅烷化GC-MS指紋圖譜可以有效表征和區(qū)分卷煙品牌，從而為卷煙品牌風(fēng)味表征、質(zhì)量評(píng)價(jià)及控制提供有益的參考。