彭開敏，葉 泰，曹 慧，袁 敏，于勁松，徐 斐

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程研究中心，上海 200093)

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是人工合成的一類高效、廣譜、神經(jīng)致毒性仿生殺蟲劑[1]，廣泛應(yīng)用于防治蔬菜、棉花、果樹、花卉害蟲[2]。但其殘留會(huì)導(dǎo)致生物體中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害。因此，新型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法研究受到了廣泛關(guān)注[3]。目前，對(duì)于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)通?；邗ユI水解建立針對(duì)水解產(chǎn)物中氰基或間苯氧基苯甲醛及其衍生物的檢測(cè)方法[4]。但嚴(yán)苛的水解條件(強(qiáng)堿性試劑)和水解產(chǎn)物的不確定性，在一定程度上限制了擬除蟲菊酯類農(nóng)藥快速檢測(cè)方法的應(yīng)用[5-6]。

羧酸酯酶能夠?qū)Ｒ坏厮鈹M除蟲菊酯類農(nóng)藥[7-8]，且水解條件溫和、操作簡(jiǎn)便[9]，在酶法農(nóng)藥快速檢測(cè)領(lǐng)域顯示出巨大的潛力和優(yōu)越性[10]。但是，通過濕法固定的羧酸酯酶表觀活性較低，水解產(chǎn)物得率偏低，限制了酶水解方法快速檢測(cè)擬除蟲菊酯農(nóng)藥的靈敏度[11]。而近年來(lái)出現(xiàn)的有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化納米材料可有效地解決該問題。Zare等[12]首先提出了一種基于金屬離子的鹽溶液合成含酶雜化“納米花”的新方法，其生物催化實(shí)驗(yàn)[13]證實(shí)納米花結(jié)構(gòu)能夠有效提高酶分子的體外催化活性和催化穩(wěn)定性[14]?；诖?，Ke等[15]將鈣離子作為無(wú)機(jī)成分和脂肪酶制備脂肪酶納米花，其活性比游離脂肪酶高308%，且制成的脂肪酶納米花的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性更高；Ye等[16]利用轉(zhuǎn)氨酶和鈣離子制備的轉(zhuǎn)氨酶雜化納米花裝載了足夠的轉(zhuǎn)氨酶并增強(qiáng)了轉(zhuǎn)氨酶的活性，所制備的納米花也是一種兼具生物識(shí)別和信號(hào)放大功能的標(biāo)記物，在病原微生物的檢測(cè)方面有廣闊的應(yīng)用前景。Zhao等[17]利用α-乙酰乳酸脫羧酶和鈣離子合成了α-乙酰乳酸脫羧酶納米花，并用于消除啤酒異味、縮短啤酒熟化時(shí)間，在啤酒釀造行業(yè)具有很大的應(yīng)用潛力。

本文制備了基于豬肝酯酶(PLE)的雜化“納米花”，通過優(yōu)化不同的制備參數(shù)獲得最優(yōu)制備條件，采用紅外光譜、掃描電鏡和元素能譜分析對(duì)豬肝酯酶雜化“納米花”進(jìn)行表征，并研究了該“納米花”對(duì)4種菊酯農(nóng)藥的水解性能?；贑a3(PO4)2-PLE雜化納米花對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的高效水解，制作酶水解型傳感器，有望為進(jìn)一步探究擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法提供新的途徑和思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

豬肝酯酶(PLE，Novocata公司)；氰戊菊酯、甲氰菊酯等菊酯類農(nóng)藥(上海農(nóng)藥研究所)；氯化鈣、海藻酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙腈、十二烷基硫酸鈉(SDS)及其他試劑(上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)；所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

TU-1901型可見分光光度計(jì)(北京普析公司)；Waters1525高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司)；Sepax HP-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm，美國(guó)賽分公司)；Quanta F250式熱場(chǎng)掃描電鏡(美國(guó)FEI公司)；S4800式冷場(chǎng)掃描電鏡(日本日立公司)；iS5傅立葉紅外掃描儀(美國(guó)Nicolet公司)；ZDDN-Ⅱ自動(dòng)型凱氏定氮儀(浙江托普公司)。

1.2 Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的制備

通過共沉淀法合成“納米花”[18]：首先在磷酸鹽緩沖溶液(10mmol/L，pH7.4)中制備質(zhì)量濃度為0.3g/L的PLE溶液，再將90μL CaCl2溶液(500mmol/L)加至6mL上述PLE溶液中，于20℃下孵育12h。離心(12000r/min，10min)收集沉淀，用水洗滌3次以除去非特異性吸附的蛋白，儲(chǔ)藏于4℃冰箱中待用。

1.3 液酶與Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花活性的測(cè)定

液酶的酶活測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)方法[19]改進(jìn)：將液酶用2mL檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(pH6.4)振蕩懸浮后，用雙蒸水稀釋3000倍。在3mL稀釋酶液中加入50μL底物(16mmolα-乙酸萘酯的丙酮溶液)混合均勻，在30℃下孵育5min，然后與0.5mL顯色劑(0.4%固蘭B的1.8%SDS溶液)混合均勻，再于30℃下保溫5min。以不加底物(α-乙酸萘酯)的反應(yīng)液作空白，測(cè)定595nm處的吸光度值。在上述條件下，每分鐘豬肝酯酶催化該反應(yīng)體系，使其在595nm處的吸光度值升高1所需的酶量定義為豬肝酯酶活力。根據(jù)下式計(jì)算液酶的活力[20]：

式中：U為酶活力(U/mg)；A為酶解底物的吸光度；A0為對(duì)照組的吸光度；V為酶解體系的總體積(mL)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；n為稀釋倍數(shù)；m為酶中蛋白質(zhì)的質(zhì)量(mg)[21]。

Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花酶活的測(cè)定：通過凱氏定氮儀測(cè)定Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的實(shí)際蛋白含量，取與上述液酶相同蛋白含量的雜化納米花，用2mL檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(pH6.4)振蕩懸浮后，用雙蒸水稀釋3000倍。采用與液酶相同的測(cè)定方法及公式對(duì)其酶活進(jìn)行測(cè)定。

1.4 Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花水解菊酯類農(nóng)藥

取66μL菊酯類農(nóng)藥(100mg/L)溶于1.25mL 緩沖液中(農(nóng)藥質(zhì)量濃度為5mg/L)，加入由1.8mg豬肝酯酶制成的Ca3(PO4)2-PLE納米花，置于47℃水浴中反應(yīng)20min，加入160μL四氯化碳旋渦振蕩5min后靜置分層，取下層四氯化碳提取液40μL，氮?dú)獯蹈刹⒓尤?0μL乙腈復(fù)溶，用液相色譜對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。

液相色譜條件：色譜柱為Sepax HP-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸水溶液-乙腈(21∶79)，流速1.1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)225nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的制備及表征

2.1.1Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的制備將氯化鈣溶液加入含有豬肝酯酶的磷酸鹽緩沖液中，孵育12 h，得到白色絮狀沉淀，即磷酸鈣納米晶體和豬肝酯酶自組裝形成的Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花。如圖1所示，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的合成包括豬肝酯酶與磷酸鈣晶體的聚集成核階段、生長(zhǎng)階段和組裝成納米花3個(gè)階段。其中，成核階段起著關(guān)鍵作用[17]。而Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的形成可由其組成成分以及結(jié)構(gòu)特征等因素反映，因此需對(duì)Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花作進(jìn)一步表征[18]。

圖1 豬肝酯酶雜化“納米花”的合成示意圖Fig.1 General diagrammatic illustration of synthesis of Ca3(PO4)2-PLE hybrid nanoflowers

采用掃描電鏡(SEM)對(duì)制備的Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花進(jìn)行形貌觀察(圖3)。由電鏡圖片可知，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的平均尺寸約為20 μm，呈圓形并由多層片層構(gòu)成花瓣?duì)?，因此具有較高的比表面積，這可能是雜化納米花酶比液酶具有更高酶活的原因之一。

2.2 制備條件的優(yōu)化

Somturk等[22]的研究表明，不同的酶濃度和金屬離子濃度均會(huì)影響雜化納米花的表觀酶活力?？疾炝素i肝酯酶的質(zhì)量濃度對(duì)Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花形成的影響，發(fā)現(xiàn)豬肝酯酶的質(zhì)量濃度為0.3 g/L 時(shí)雜化納米花的酶活最高(圖4A)，隨著豬肝酯酶質(zhì)量濃度的升高或降低，酶活力均降低，這可能是由于在相對(duì)高濃度的酶中，納米花所有的花瓣嚴(yán)格地彼此嵌入，并且表面無(wú)空隙結(jié)構(gòu)，而中等濃度的豬肝酯酶則能合成具有孔隙結(jié)構(gòu)的相當(dāng)均勻的球形雜化納米花。當(dāng)豬肝酯酶的質(zhì)量濃度較低時(shí)，納米花不能形成片層狀結(jié)構(gòu)[23]。因此，選擇豬肝酯酶的質(zhì)量濃度為0.3 g/L。

鈣離子濃度也會(huì)影響Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的結(jié)構(gòu)(圖4B)，這是因?yàn)樵诤线m的Ca2+濃度(500 mmol/L)時(shí)，會(huì)形成較為均一穩(wěn)定的雜化納米花結(jié)構(gòu)，而在較低的Ca2+濃度下，則不會(huì)形成雜化納米花的結(jié)構(gòu)，且當(dāng)Ca2+濃度低至250 mmol/L時(shí)，酶活明顯較低，隨著Ca2+濃度升至500 mmol/L，酶活達(dá)到最高。之后，繼續(xù)提高Ca2+濃度，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的酶活逐漸下降并在Ca2+濃度高于1 000 mmol/L時(shí)達(dá)到平穩(wěn)，原因可能是過高的氯化鈣濃度使Ca2+濃度相對(duì)豬肝酯酶達(dá)到飽和，不會(huì)參與到Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的形成過程。

磷酸鹽緩沖液濃度(5、10、20、30、40、50 mmol/L)、pH值(pH 6.0、7.4、8.0、9.0、10.0)以及溫度對(duì)納米花形成的形態(tài)影響不大，但對(duì)其酶活性仍有一定的影響。磷酸鹽緩沖液的濃度為10 mmol/L時(shí)，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的酶活達(dá)到最高，過高的磷酸鹽濃度會(huì)抑制Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的活力。在pH 7.4和20 ℃時(shí)，合成的Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花具有最高的酶活。

2.3 酶活對(duì)比及對(duì)不同菊酯類農(nóng)藥的水解情況

在最優(yōu)條件下，測(cè)定Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花和游離酶的酶活，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花酶活為液酶的169%(圖5A)。這可能是因?yàn)椋篊a3(PO4)2-PLE納米花的顆粒較小，比表面積大且表面具有較多的空隙結(jié)構(gòu)，這些空隙可以增加酶和底物的接觸面積；此外，納米級(jí)包埋和豬肝酯酶的協(xié)同效應(yīng)以及豬肝酯酶在Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花中形成的酶構(gòu)象也綜合提高了Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的酶活[22，24]。

采用合成的Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花對(duì)氰戊菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯進(jìn)行水解(圖5B)，同時(shí)與液酶的水解情況進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花對(duì)上述4種農(nóng)藥的水解效果均優(yōu)于液酶。但對(duì)于不同種類的菊酯類農(nóng)藥，納米花的水解效率不同，其中水解效果最好的氰戊菊酯比水解效果最差的氟氯氰菊酯的水解效率高26%，底物特異性的差異表明固定的Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花對(duì)于不同的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥可能具有不同的適用性。

2.4 Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的循環(huán)使用性

為進(jìn)一步驗(yàn)證Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的可重復(fù)利用性，本實(shí)驗(yàn)選取氰戊菊酯進(jìn)行循環(huán)水解實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花在第2次循環(huán)仍保持70%以上的回收效率。隨著循環(huán)次數(shù)的增加，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的殘留活性逐漸降低，6次循環(huán)反應(yīng)后其活性僅為10%，這可能是由于每次循環(huán)后Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花在離心分離過程中的質(zhì)量損失所致。在實(shí)際應(yīng)用過程中，可考慮選擇載體對(duì)Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花進(jìn)一步固定，避免因循環(huán)過程中酶的質(zhì)量損失而導(dǎo)致酶活降低。

3 結(jié) 論

本文表征了由Ca2+離子和豬肝酯酶合成的Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花的組成和形貌，并對(duì)其合成條件進(jìn)行了優(yōu)化。同時(shí)研究了該Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花在水解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥方面的應(yīng)用，結(jié)果顯示，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花對(duì)Ⅰ型(氯菊酯)、Ⅱ型擬除蟲菊酯(氰戊菊酯、甲氰菊酯、氟氯氰菊酯)類農(nóng)藥均有較好的水解效果。與游離豬肝酯酶相比，Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花顯示出更高的酶活性和重復(fù)利用能力，在基于酶法檢測(cè)菊酯類農(nóng)藥的樣品前處理方面顯示了巨大的應(yīng)用前景。今后可利用Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花設(shè)計(jì)酶水解型傳感器，即基于Ca3(PO4)2-PLE雜化納米花對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的良好水解能力，由得到的水解產(chǎn)物向相應(yīng)的裝置提供檢測(cè)信號(hào)，再利用轉(zhuǎn)換器將檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)換成可定量分析的光、電信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的定量檢測(cè)。