王曉歡

(天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072)

隨著新藥的不斷開發(fā)，藥物分子呈現(xiàn)多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，48.6%的生物活性藥物保持中性形式，51.4%的藥物以鹽的形式存在，其中包括38.6%的堿性藥物和12.8%的酸性藥物[1]。因此對復(fù)雜類型的藥物進(jìn)行有效分離非常重要。高效液相色譜作為一種分離手段在藥物分析領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。反相色譜(RPLC)以其廣泛的選擇性和靈敏度，成為最常用的色譜模式，但對極性和離子型化合物保留很弱，在高水相條件下不易潤濕，且殘留硅醇基將導(dǎo)致堿性化合物的峰形拖尾[2]。離子交換色譜(IEC)通過靜電相互作用，實(shí)現(xiàn)了離子型化合物的分離，但對中性化合物無保留。離子對色譜(IPC)通過引入離子對試劑，提高了對離子型化合物的保留和選擇性，能夠同時分離中性和離子型的化合物[3]，但平衡時間長，離子對試劑不易洗脫，且大多數(shù)離子對試劑與質(zhì)譜不兼容。

混合模式色譜(MMC)的發(fā)展解決了單一模式色譜分離容量受限的難題，通過固定相表面不同功能基團(tuán)與溶質(zhì)的多種相互作用，可用于不同色譜模式分離或不同類型化合物的同時分離[4-5]。目前，該領(lǐng)域引起了許多研究者的興趣，多種保留機(jī)制結(jié)合的混合模式色譜被開發(fā)。Wei等[6]通過極性嵌入方法將C18和季銨基團(tuán)相結(jié)合制備了一種反相/陰離子交換(RP/SAX)混合模式固定相，可在反相模式下分離甲苯和乙苯，離子交換模式下分離酸性化合物，并且該固定相能與全水相兼容。Zimmermann等[7]通過N-(10-十一酰)-3-氨基奎寧環(huán)改性二氧化硅基質(zhì)，合成了一種反相/弱陰離子交換(RP/WAX)混合模式固定相，相比于IPC和WAX在分離寡核苷酸方面具有更強(qiáng)的選擇性。Li等[8]通過在多孔硅球表面多次涂覆聚合物的方法，開發(fā)了一種反相/陰離子交換/親水(RP/SAX/HILIC)三模式固定相，可在HILIC模式下分離極性小分子，RP/SAX混合模式下同時分離中性和離子型化合物。

強(qiáng)陽離子交換色譜作為混合模式色譜中最重要的保留模式之一，能夠提供獨(dú)特的保留機(jī)制和選擇性，已廣泛用于金屬離子[9]、堿性藥物[10]和生物分子的分離[11-12]。傳統(tǒng)磺酸基陽離子固定相常通過在硅膠表面鍵合苯基的基礎(chǔ)上，用氯磺酸酸化制得。然而，強(qiáng)酸條件易導(dǎo)致鍵合相丟失，同時磺化反應(yīng)劇烈，導(dǎo)致磺酸基表面覆蓋率不可控，且對環(huán)境不利。而點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)是在溫和條件下，通過不同小單元的拼接，快速精準(zhǔn)的合成各種目標(biāo)分子，該方法主要包括疊氮-炔基Husigen環(huán)加成反應(yīng)、Diels-Alder反應(yīng)和巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)3類，具有簡單、高效和高選擇性的特點(diǎn)，在分離材料制備中得到越來越多的應(yīng)用。而無金屬離子參與的巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的條件溫和、環(huán)保、選擇性好、產(chǎn)率高，為色譜固定相表面功能化修飾提供了重要途徑[13-15]。

本文通過巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)方法，在硅膠表面鍵合巰基的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行苯磺酸和苯基的表面改性，制備RP/HILIC/SCX混合模式色譜固定相。采用元素分析和13C固體核磁共振(13C NMR)對該固定相進(jìn)行表征，利用多種色譜評價(jià)體系對其反相、親水和離子交換色譜行為進(jìn)行評價(jià)，并將其應(yīng)用于二甲雙胍及其雜質(zhì)的檢測，以及酸性、中性和堿性藥物的同時分離。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Varian InfinityPlus-300MHz固體核磁共振譜儀(美國Palo Alto公司)；Vario Micro Cube元素分析儀(德國Elementar公司)；安捷倫1100高效液相色譜分析儀(美國安捷倫公司)；球形硅膠(9.8μm，292m2/g，10nm)、Haskel AW-60高壓勻漿裝柱系統(tǒng)(天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心)。

巰丙基三甲氧基硅烷(MPTMS，湖北武大有機(jī)硅新材料股份有限公司)；對苯乙烯磺酸鈉(上海源葉生物科技有限公司)；苯乙烯、三乙胺(TEA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、乙苯、丙苯、丁苯、戊苯、1-萘胺、對苯二胺、三聚氰胺(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；甲苯、對硝基苯胺、對氯苯胺、苯胺(天津市江天化工技術(shù)有限公司)；雙氰胺、鹽酸二甲雙胍、尿嘧啶、尿苷、腺苷、腺嘌呤、胞嘧啶(上海麥克林生化科技有限公司)；對乙酰氨基酚、布洛芬、替硝唑、吲哚美辛、硫酸沙丁胺醇、鹽酸普魯卡因胺、鹽酸可樂定標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 Ph/BS固定相的制備

稱取4g活化的SiO2微球于反應(yīng)釜中，加入1.8mL(9.6mmol) MPTMS和1.0mL(7.2mmol)TEA，于150℃馬弗爐中反應(yīng)8h，冷卻后分別用甲醇、乙醇-水(1∶1，體積比)、甲醇洗滌,80℃下減壓干燥過夜，得到巰丙基硅膠(MPS)。

將4g MPS微球和80mL甲醇分散于150mL反應(yīng)瓶中，然后加入0.04g(0.24mmol)AIBN、0.165g(0.8mmol)對苯乙烯磺酸鈉(SS)和184μL(1.6mmol)苯乙烯(St)，連續(xù)振蕩溶解后通氮?dú)獬?，用四氟帶密封，置?0℃恒溫水浴搖床中振搖12h，依次用甲醇、乙醇-水(1∶1)、甲醇洗滌后,80℃下減壓干燥過夜，得到苯基-苯磺酸基雙配體混合模式固定相(Phenyl/Benzenesulfonate phase,Ph/BS)。與上述合成途徑相同，反應(yīng)過程不加St，得到苯磺酸修飾的單配體固定相(Benzenesulfonate phase,BS)作對照。將Ph/BS填料和BS填料裝入不銹鋼柱管(150mm×4.6mm i.d.) 得到色譜分析柱。

1.3 色譜評價(jià)

反相評價(jià)體系：分離苯同系物：流動相為甲醇-水(60∶40,體積比)，檢測波長為254nm。

親水評價(jià)體系和兩親性保留機(jī)理研究：分離核苷及堿基類化合物，流動相為乙腈-20mmol/L乙酸銨，檢測波長為254nm。

離子交換評價(jià)體系：分離含氮堿性化合物，流動相為乙腈-60mmol/L KH2PO4(pH3.0)(50∶50,體積比)，檢測波長為240nm。以上體系的流速均為1.0mL/min，柱溫25℃。

1.4 應(yīng) 用

分離雙氰胺、三聚氰胺和二甲雙胍：流動相為1.7%NH4H2PO4(pH3.0)，檢測波長為218nm，流速為1.0mL/min，柱溫為40℃。

分離酸性、中性和堿性藥物:流動相為乙腈-60mmol/L KH2PO4(pH3.0)(35∶65,體積比)，檢測波長為220nm，流速為1.5mL/min，柱溫為30℃。

圖1 Ph/BS固定相的固體核磁碳譜Fig.1 13C CP MAS NMR spectrum of Ph/BS stationary phase

2 結(jié)果與討論

2.1 表 征

Ph/BS固定相的表面結(jié)構(gòu)通過13C NMR表征，并對碳原子進(jìn)行歸屬(圖1)。烷基鏈上的碳原子和甲氧基碳原子的信號在10～51ppm，苯環(huán)上的碳原子信號在126～144ppm，其中與磺酸基相連的碳原子在高化學(xué)位移處出峰。結(jié)果表明苯磺酸和苯基已在固定相表面成功鍵合。

通過元素分析對固定相進(jìn)行定量表征。巰丙基鍵合硅膠(MPS)的元素含量分別為：C3.88%,S2.42%，根據(jù)式(1)計(jì)算得到巰丙基鍵合量為4.23μmol/m2。

(1)

其中，SBET為固定相的比表面積，36和118分別表示增加1個MPS分子所增加的碳元素質(zhì)量和總質(zhì)量。Ph/BS固定相的元素含量為：C7.86%,S2.86%,對苯乙烯磺酸鈉(SS)和苯乙烯(St)的鍵合量測定公式如下：

(2)

(3)

計(jì)算得到Ph/BS固定相上苯磺酸和苯基的鍵合量分別為0.48、0.98μmol/m2,BS固定相上苯磺酸的鍵合量為0.55μmol/m2。兩種固定相表面的苯磺酸鍵合量基本相同，差別僅在于苯基鍵合量不同。因此，巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)方法制備雙配體混合模式固定相，保證了合適的磺酸基鍵合量，并且能夠靈活調(diào)控苯基的鍵合量從而進(jìn)一步提高固定相的碳載量。

2.2 色譜評價(jià)

2.2.1反相評價(jià)采用一系列烷基苯同系物評價(jià)了Ph/BS固定相的疏水性和亞甲基選擇性，在相同的色譜條件下，烷基苯同系物在BS和Ph/BS兩個固定相上均得到較好的保留和分離(圖2)，但在雙配體Ph/BS固定相上的保留和分離度明顯增加，原因是疏水性苯基增加了固定相的反相作用和π-π相互作用?？疾炝肆鲃酉嘀兴?35%、40%、45%、50%)對Ph/BS固定相上烷基苯同系物保留因子的影響，結(jié)果顯示溶質(zhì)的保留隨流動相中水相比例的增加而顯著增加，進(jìn)一步證明了Ph/BS固定相的反相色譜行為。以保留因子的對數(shù)與烷基苯側(cè)鏈上的亞甲基數(shù)目作圖，兩者在不同流動相條件下均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(見圖3)，說明Ph/BS固定相具有較好的亞甲基選擇性。

圖3 Ph/BS固定相上烷基苯同系物lgK與亞甲基數(shù)目的關(guān)系圖Fig.3 Plot of lgK vs number of methylene groups on Ph/BS phase mobile phase:() methanol-water(60∶40); () methanol-water(55∶45);() methanol-water(50∶50)

2.2.2親水評價(jià)極性磺酸基的存在使得Ph/BS固定相可用于親水色譜模式[16]。核酸類小分子化合物常用于評價(jià)親水固定相的色譜性能，因此考察了流動相中不同乙腈-20 mmol/L乙酸銨體積比(90∶10、94∶6、95∶5)時5種核苷和堿基在BS和Ph/BS兩種固定相上的色譜行為(圖4)。由圖可知，在上述3種流動相條件下，5種物質(zhì)在兩個固定相上均得到較好分離，且出峰次序一致，為尿嘧啶<尿苷<腺苷<腺嘌呤<胞嘧啶。隨著流動相中乙腈含量的增加，溶質(zhì)的保留和分離度相應(yīng)增加，且極性越大的化合物變化越明顯，體現(xiàn)了親水色譜的保留特征。在相同的色譜條件下，極性溶質(zhì)在兩個固定相上的親水保留行為差別不大，原因是其表面的磺酸基鍵合量基本一致，故與溶質(zhì)間的極性相互作用也基本相同。

2.2.3兩親性保留機(jī)理上述結(jié)果表明，由于Ph/BS固定相表面含有親水基團(tuán)(—SO3H)和疏水基團(tuán)(—Ph，—CH2)，因此具有親水和反相雙重保留特性。實(shí)驗(yàn)以尿嘧啶、尿苷、腺苷、腺嘌呤、胞嘧啶5種核苷和堿基作為測試樣品，在5%～95%范圍內(nèi)改變流動相的水相含量，考察溶質(zhì)分子的保留因子與流動相中水相含量的關(guān)系。結(jié)果表明在低水相條件下(<50%)，溶質(zhì)的保留因子隨水相含量的增加而減小，說明親水保留行為占主導(dǎo)。而在高水相條件下(>50%)，溶質(zhì)的保留因子隨流動相中水相含量的增加而增大，體現(xiàn)了反相保留特性。綜上，溶質(zhì)在該固定相上的保留隨流動相中水相含量的改變呈現(xiàn)U型曲線特征，說明Ph/BS固定相具有RP/HILIC雙重保留機(jī)理[17-18]。

2.2.4離子交換評價(jià)在酸性條件下，對硝基苯胺、對氯苯胺、1-萘胺、苯胺、三聚氰胺和鄰苯二胺6種胺類小分子化合物解離帶正電荷，可用于評價(jià)Ph/BS固定相的離子交換行為。在乙腈-60 mmol/L KH2PO4(pH 3.0)(50∶50)流動相條件下，6種化合物得到較好的保留和分離(圖5)。由圖5知，6種胺類小分子的保留順序與其pKa有關(guān)，且pKa越大(即堿性越強(qiáng))，保留時間越長，符合離子交換的保留特征。除了對硝基苯胺的保留較弱外，其他5種胺類化合物的保留因子隨著流動相中鉀離子濃度的增加而減小，進(jìn)一步證明了離子交換保留機(jī)理。將5種溶質(zhì)的保留因子對數(shù)與流動相中鉀離子濃度對數(shù)作圖，得到斜率依次為-0.52、-0.50、-0.78、-1.04、-1.13。由于對氯苯胺、1-萘胺和苯胺的lgP較大，除離子交換作用外，與固定相間還存在反相作用[19]，因此其斜率小于理論值-1。而三聚氰胺和鄰苯二胺的反相作用很弱，幾乎只有離子相互作用，因此斜率接近于理論值-1。

圖4 BS固定相(A) 和 Ph/BS固定相(B)對核苷類化合物的分離Fig.4 Separation of nucleoside compounds on BS phase(A) and Ph/BS phase(B)1.uracil，2.uridine，3.adenosine，4.adenine，5.cytosine;volume ratio of acetonitrile-20 mmol/L ammonium acetate：a.90∶10,b.94∶6,c.95∶5

圖5 Ph/BS固定相分離胺類化合物的色譜圖Fig.5 Chromatogram of amine solutes separation on Ph/BS phase1.p-nitroaniline;2.p-chloroaniline;3.1-naphthylamine;4.aniline;5.melamine;6.p-phenylene diamine

2.3 應(yīng) 用

2.3.1二甲雙胍及其雜質(zhì)的分離二甲雙胍是一種降血糖藥物，常用于Ⅱ型糖尿病的治療。雙氰胺和三聚氰胺作為其反應(yīng)中間體，具有一定毒性，必須進(jìn)行嚴(yán)格控制以確保用藥安全有效。在“1.4”條件下，Ph/BS固定相能夠很好地分離二甲雙胍和原料雜質(zhì)雙氰胺(圖6)，且三聚氰胺與二甲雙胍的分離度為11.4，滿足藥典規(guī)定的分離度大于10.0的要求。另外，三聚氰胺和二甲雙胍的峰形對稱，理論塔板數(shù)分別為30 013和24 080，相比于藥典分析方法(15 000/m)的柱效更高，因此，Ph/BS固定相可在SCX模式下用于二甲雙胍制劑的質(zhì)量檢測和控制。

2.3.2酸性、中性與堿性藥物的同時分離由于Ph/BS固定相具有RP/SCX性質(zhì)，可用于中性和離子型藥物的同時分離。在“1.4”條件下，中性(對乙酰氨基酚、替硝唑)、酸性(布洛芬：pKa 5.2；吲哚美辛：pKa 4.5)和堿性藥物(沙丁胺醇：pKa 9.3；普魯卡因胺：pKa 9.2；可樂定：pKa 8.05)在Ph/BS固定相上均得到較好的分離(圖7)。在pH 3.0條件下，布洛芬和吲哚美辛不解離，因此與磺酸基所帶負(fù)電荷不存在離子排斥作用，從而在固定相上保留。中性和酸性藥物在Ph/BS固定相上的保留依靠疏水相互作用，lgP越大，保留越強(qiáng)，洗脫次序?yàn)閷σ阴０被?lgP1.42)<替硝唑(lgP2.14)<布洛芬(lgP3.07)<吲哚美辛(lgP3.93)。堿性藥物在pH 3.0條件下帶正電荷，除疏水作用外還存在離子交換作用，因此比酸性和中性藥物的保留更強(qiáng)。

圖6 Ph/BS固定相分離雙氰胺、三聚氰胺和二甲雙胍的色譜圖Fig.6 Chromatogram of dicyandiamine,melamine and melbine separated on Ph/BS phase1.dicyandiamine;2.melamine;3.melbine

圖7 Ph/BS固定相同時分離酸性、中性和堿性藥物的色譜圖Fig.7 Chromatogram of acidic,neutral and basic drugs separated on Ph/BS phase1.acetaminophen;2.tinidazole;3.ibuprofen;4.indomethacin;5.salbutamol;6.procainamide;7.clonidine

3 結(jié) 論

本文制備并表征了雙配體苯磺酸混合模式固定相。采用多種測試體系對Ph/BS固定相進(jìn)行色譜性能評價(jià)，發(fā)現(xiàn)其分離過程涉及疏水作用、π-π作用、極性作用和陽離子交換等多種作用形式，對核苷類小分子的保留體現(xiàn)了RP/HILIC雙重保留機(jī)理。相比于單配體BS固定相，在保證相同極性的條件下，Ph/BS固定相可添加疏水苯基來增加反相保留行為，說明該方法可靈活調(diào)節(jié)各功能配體的比例，以滿足不同的分離要求。該混合模式固定相在SCX模式下用于二甲雙胍及其雜質(zhì)的高效分離分析，效果優(yōu)于藥典方法；在RP/SCX 混合模式下可實(shí)現(xiàn)酸性、中性和堿性藥物的同時分離。研究結(jié)果表明，所制備的固定相在復(fù)雜體系的分離分析方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。