丁莉莎，姚 濤，江培學，楊志軍，賀健梅，鄭 軍，陳 曦

（1湖南省疾病預防控制中心，湖南 長沙 410005；2長沙市一醫(yī)院，湖南 長沙 410011；3上海星耀醫(yī)學科技發(fā)展有限公司，上海 200083）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的前 C區(qū)及C區(qū)啟動子的變異是近十年來肝炎領域的研究熱點。上述兩個區(qū)域，以及前S區(qū)和EnhⅡ區(qū)發(fā)生突變已被證明與肝纖維化和肝癌的產生密切相關。由于C區(qū)，特別是基本核心啟動子區(qū)在病毒復制中起著重要作用，一旦變異將影響到乙型肝炎e抗原（HBeAg）的表達和宿主的免疫應答，并直接影響慢性肝病患者的病程進展及藥物治療的效果［1－4］。近年來，乙型肝炎病毒合并人類免疫缺陷病毒1 型 （human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）共感染人群數(shù)量不斷上升，防治形勢十分嚴峻，而HIV與肝炎病毒交叉感染會導致感染者免疫水平下降，病毒復制活躍，引發(fā)肝臟持續(xù)性炎癥因子的表達和單核淋巴細胞的活化，加速病程進展。相對于HBV單感染，共感染患者體內的HBV受到HIV-1和宿主免疫系統(tǒng)的共同作用和影響，尚不清楚是否會導致病毒變異和進化的加快。本研究目的為分析共感染人群HBV重點區(qū)域的變異，初步探討此問題。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2017年1月—2018年1月長沙市第一醫(yī)院和郴州市第二人民醫(yī)院進行HIV和HBV檢測的患者，經知情同意后隨機挑選40例HIV確證陽性且HBV DNA陽性作為共感染試驗組，40例HBV DNA陽性作為單感染對照組，于未開展抗病毒治療前采血。對乙型肝炎的診斷符合乙型病毒性肝炎診斷標準（WS 299－2008）。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 ABI 7500熒光PCR儀為ABI公司生產，普通PCR儀為珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司生產。

1.2.2 試劑 乙肝五項檢測試劑盒購自珠海麗珠醫(yī)藥公司，HBV DNA提取試劑盒、定量試劑盒和擴增試劑盒均由上海星耀醫(yī)學科技發(fā)展有限公司提供。

1.3 全基因組擴增及測序

1.3.1 引物 全基因組擴增引物：HP1 5’→3’CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTC TGCCTAATCA；HP2 5’→3’CCGGAAAGCTT-GAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG。

1.3.2 擴增體系及步驟 試劑準備、標本處理和加樣按照定量試劑盒說明書和實時熒光定量PCR儀操作規(guī)程進行。定量檢測反應條件為：50℃，2 min→94℃，5 min→94℃，10 s→60℃，40 s共40個循環(huán)。而全基因組擴增體系（50μL）為：DNA Polymerase 0.5μL，Buffer（Mg2＋plus）10μL，dNTP Mixture 4μL ，Primer HP11 1μL，Primer HP21μL，HBV DNA5μL，ddH2O28.5μL。擴增程序為：94℃，1 min→94℃，40 s→60℃，90 s→68℃，3 min共40個循環(huán)，每10個循環(huán)增加2 min，30個循環(huán)以后9 min。

1.3.3 結果檢測及測序 采用 ABI 7500 real time Data Analysis分析定量結果。全基因組擴增則每管分別取5μL PCR擴增液，1.5%瓊脂糖凝膠100 V 電泳30 min，在3.2 kb處有條帶的視為成功擴增目的片段，并送上海生工測序。

1.4 序列分析應用 NCBI BLAST進行基因分型和序列分析，標準參照序列為GQ924603和FJ562219。

1.5 總體變異率比較 以每100個氨基酸／核苷酸中發(fā)生氨基酸／核苷酸替換數(shù)目的百分比來計算［2］，前S區(qū)分析片段總長174個氨基酸，前C區(qū)和BCP區(qū)分析片段總長158個核苷酸。前S區(qū)總突變率＝氨基酸突變數(shù)／（測序例數(shù)×174）×100%，前C區(qū)和BCP區(qū)總突變率＝氨基酸突變數(shù)／（測序例數(shù)×158）×100%。

1.6 統(tǒng)計方法 應用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布采用t檢驗比較兩組間均數(shù)，非正態(tài)分布采用秩和檢驗比較兩組間中位數(shù)，采用χ2檢驗對各組間差異性進行分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基本信息 試驗組40例患者中，僅21例（52.50%）能成功測得HBV全基因組序列，其中男性17例（80.95%），女性4例（19.05%）；≤40歲者10例（47.62%），＞40歲者11例（52.38%）。而對照組40例患者中，有38例（95.00%）成功測得HBV全基因組序列，檢出的基因型和HBV載量值以及性別、感染途徑等見表1。湖南省HIV患者感染HBV基因（亞）型以B型為主。試驗組與對照組HBV載量值和不同基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。試驗組年齡為（40.7±15.0）歲，對照組為（36.3±15.2）歲，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 成功測得HBV全基因組序列的兩組患者基本資料比較Table 1 Comparison in basic data of two groups of patients who were successfully detected whole-genome sequence

2.2 序列比對與分析

2.2.1 前S區(qū)序列分析比較 前S區(qū)序列試驗組4份樣本中22個氨基酸發(fā)生突變，其中，2個前S1區(qū)缺失突變，20個前S2區(qū)缺失突變。對照組6份樣本中42個氨基酸發(fā)生突變，其中2個為起始位點突變，16個前S1區(qū)缺失突變，24個前S2區(qū)缺失突變。實驗組和對照組前S區(qū)氨基酸總體缺失突變率分別為0.60%、0.64%，差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.042，P＞0.05）。

2.2.2 前C區(qū)和BCP區(qū)序列分析分析 前C區(qū)和BCP區(qū)序列試驗組12份樣本45個核苷酸發(fā)生突變，對照組32份104個核苷酸發(fā)生突變，兩組前C區(qū)和BCP區(qū)各個主要突變位點變異發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2～3。試驗組和對照組前C區(qū)和BCP區(qū)總體變異發(fā)生率分別為1.36%、1.73%，差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝1.920，P＞0.05）。

表2 兩組患者血清標本HBV前C區(qū)突變率比較［份（%）］Table 2 Comparison in mutation rates in pre-C region of HBV in serum specimen of two groups of patients（No.of specimens［%］）

表3 兩組患者血清標本HBV基本核心啟動子區(qū)突變率比較［份（%）］Table 3 Comparison in mutation rates in BCP region of HBV in serum specimen of two groups of patients（No.of specimens［%］）

3 討論

HBV是一種不完全雙鏈DNA病毒，基因組全長3.2 kb，由四個重疊的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）組成，分別是前S／S（preS／S）區(qū)，前C／C（pre core／core）區(qū)，X（transcriptional co-activator）區(qū)和P（DNA polymerase）區(qū)。由于在復制過程中逆轉錄酶缺乏校正功能，以及免疫逃避等因素的作用，HBV常發(fā)生變異。前C區(qū)編碼HBeAg的前體蛋白，是宿主免疫系統(tǒng)攻擊的靶位；而C啟動子區(qū)，特別是基本核心啟動子 （basic core promoter BCP）區(qū)在前C mRNA和前基因組RNA（pgRNA）的轉錄和調控中起著重要的作用，這兩個區(qū)域的變異直接影響到 HBeAg的表達、病毒復制狀態(tài)及肝功能［1－2］。前C區(qū)的常見變異為G1896A和G1899A，BCP區(qū)為T1753V和A1762T＋G1764A雙突變，在不同亞型中突變關鍵位點稍有差異，通常與慢性肝病的病情進展及預后相關，能降低免疫應答并影響干擾素的治療效果［3－6］，被認為是肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的高風險因素之一［7］。前S區(qū)的缺失突變可導致HBV表面蛋白表達量減少，并且通過消除HLA限制性B細胞和T細胞表位，使得病毒持續(xù)存在［5］。前S1／S2區(qū)的缺失突變也經常在隱匿性感染（OBI）病例中檢測到［8］。此外，HBV S基因中302G→A、345G→A引起的氨基酸變異S50G、Y64C，可能是導致母嬰傳播HBV宮內感染的原因［9］。而近年來，HBVX區(qū)基因突變與原發(fā)性肝癌預后的關系也得到證實［10－12］。

由于HIV與HBV具有相同或相似的感染途徑，均可經血液、性接觸和母嬰等途徑傳播，兩類病毒通常發(fā)生重疊感染：約有90%～95%的HIV感染者曾經感染過HBV，其中有大約10%～15%發(fā)展為慢性乙型肝炎患者［13］，雙重感染主要高度流行于注射吸毒人群和獻血者中［14－15］。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，大量HIV與HBV感染患者血漿HBV VL值較高而HBeAg呈陰性，且與HBV亞型有一定相關性，提示共感染患者體內存在HBV病毒的高度變異［16］。本實驗共收集40份 HIV-1／HBV共感染血清樣本，40份HBV單獨感染血清樣本，但有HBV載量值較高且手工提取HBV DNA定量也為陽性的19份共感染樣本無法擴增或者未測序成功，失敗率遠高于HBV單感染者，原因值得進一步分析，推測可能為引物靶定的位置發(fā)生了突變或者個體內突變亞株較多，導致測序紊亂。在成功測序的樣本中，共感染組雖然在前S區(qū)、前C區(qū)和BCP區(qū)三個重要區(qū)域均有發(fā)生缺失突變或者 G1896A、A1762T／G1764A等（已經證明與病情進展和預后有關）關鍵位點的突變，但突變率與HBV單感染組相比無差異，初步說明短時間內HIV-1的存在對HBV的突變暫無明顯影響。但如果長期共存相互作用，HIV-1導致機體免疫功能下降、應答緩慢，HBV復制活躍，是否會發(fā)生變化還需更長時間的觀察和研究。值得指出的是，部分共感染患者出現(xiàn)一些新的HBV突變位點，如G1854T、A1859T、G1876A等，新的突變位點是否會影響宿主的免疫應答和治療效果也需進一步分析。