王洪善，張曉娟，李恒，史勁松，許正宏,3

1(江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫,214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫,214122)

益生菌和益生元國際科學(xué)協(xié)會(ISAPP)對益生元有了新定義：能夠被宿主微生物選擇性利用，并有益于宿主健康的物質(zhì)[1]。益生元對于腸道健康及其他多種疾病的作用已被廣泛研究[2]。具有雙歧效應(yīng)(bifidogenic effect)及增加丁酸產(chǎn)物的益生元能夠提升腸道屏障效應(yīng)并改善宿主代謝，有助于體重的減輕[3]。利用益生元改善宿主的代謝，提升腸道微環(huán)境的多樣性，進(jìn)而改善營養(yǎng)型肥胖相關(guān)的癥狀，已成為研究的熱點。

研究表明，腸道微生物與肥胖有著密切的關(guān)系，肥胖人群體內(nèi)有著更高豐度的厚壁菌門微生物及更低豐度的擬桿菌門豐度微生物[4]。腸道菌群已經(jīng)被證明能夠幫助減輕體重，改善胰島素抵抗等癥狀。一項研究顯示，從瘦體供體到代謝綜合征肥胖患者進(jìn)行的糞便微生物群移植可提高肥胖患者胰島素敏感性[5]。有關(guān)腸道微生物與肥胖關(guān)系的認(rèn)識還在不斷發(fā)展中，通過調(diào)節(jié)腸道菌群來干預(yù)肥胖已逐漸被人們所接受。

魔芋甘露寡糖(mannan-oligosaccharide, MOS)是通過化學(xué)或生物法降解魔芋葡甘需聚糖獲得，魔芋葡甘露聚糖是一種從魔芋塊莖中提取的多糖。它由D-甘露糖和D-葡萄糖以1.6∶1的摩爾比且大部分通過β-1,4鍵連接而成[6]。研究表明，MOS具有多種生理活性，能夠改善腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整性，調(diào)節(jié)腸道微生物群落，并提高免疫活性[7-9]。因此，作為一種天然的健康食品，MOS被廣泛用作飼料和食品添加劑。此外，MOS具有降低血脂濃度，抑制人體內(nèi)脂質(zhì)的吸收功能[10]，MOS還具有潛在的減肥功效。已有關(guān)于MOS對宿主腸道微生物影響的研究多局限于MOS作為飼料添加劑的功效，對肥胖宿主腸道微生物的研究較少，且研究方法較為原始，并不能很好地揭示腸道微生物的變化。

該文研究了MOS對高脂飲食小鼠體重及腸道中產(chǎn)酸的影響，并利用16s高通量測序技術(shù)，研究了不同飲食小鼠腸道微生物的變化，初步探討了MOS對高脂飲食小鼠的益生效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘露寡糖：成都永安緣和生物科技有限公司；24只雄性SPF級C57BL/6J小鼠：南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院[許可證號：SCXK(蘇)2015-0001]；60%高脂飼料及10%低脂對照飼料：南通特洛菲飼料科技有限公司；小鼠糞便DNA提取試劑盒：德國QIAGEN公司；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸分析標(biāo)準(zhǔn)品：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要儀器

NanoDrop 2000超微量分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司；MiSeq高通量測序系統(tǒng)，美國Illumina公司；氣相色譜儀，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物實驗

24只6周齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠，低脂飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為4組(每組6只)：1組為陰性對照組(NC)，提供10%低脂飼料飲食；1組為低脂飼料灌胃甘露寡糖組(NC+MOS)；1組為高脂對照組(HFD)，提供60%高脂飲食；1組為高脂飲食灌胃甘露寡糖組(HFD+MOS)。甘露寡糖用水溶解后經(jīng)灌胃提供給小鼠，甘露寡糖灌胃量為每天6 g/kg體重，灌胃體積為0.1 mL/10g體重，對照組灌胃相應(yīng)體積的水。實驗周期為11周，實驗期間，每周檢測小鼠的體重變化。第11周時，收集小鼠糞便，立即存儲于-80 ℃冰箱中，用于DNA的提取；最后，處死小鼠，收集小鼠盲腸內(nèi)容物，用于短鏈脂肪酸的檢測。所用動物實驗相關(guān)實驗方案及操作均經(jīng)江南大學(xué)動物管理和使用委員會批準(zhǔn)。

1.3.2 盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸檢測

盲腸內(nèi)容物稱重后溶于1 mL去離子水中，充分振蕩混勻，12 000 r/min離心5 min，取上清，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾，用于氣相色譜檢測。配制不同濃度梯度相應(yīng)短鏈脂肪酸標(biāo)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

氣相色譜分析利用島津(Shimadzu) GC-2010氣相色譜儀進(jìn)行。色譜柱為DB-WAX毛細(xì)管柱(30 mol/L，I D 0.32 mm×0.5 μm)，進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：250 ℃；程序升溫：初始溫度50 ℃，保持3 min, 隨后以6 ℃/min的速率升溫到120 ℃，以10 ℃/min的速率升溫到220 ℃，保持5 min；載氣(N2)流量：3 mL/min；燃?xì)?H2)流量：47 mL/min；助燃?xì)?Air)流量：400 mL/min；分流比：1∶3；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.3 小鼠糞便DNA提取

最后1周小鼠糞便微生物DNA利用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。DNA提取后利用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測DNA濃度及質(zhì)量。

1.3.4 小鼠腸道微生物16 s高通量測序

利用Illumina MiSeq高通量測序平臺對提取的最后1周小鼠糞便微生物DNA進(jìn)行16 s高通量測序(共23個樣本，1個樣本被污染)。測序區(qū)域為V3～V4區(qū)，測序引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)- 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，不同樣本在引物5′端加入6 bp條碼序列用于區(qū)分樣品。高通量測序?qū)嶒炗缮虾Ｃ兰镝t(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.5 高通量測序數(shù)據(jù)分析處理

MiSeq測序數(shù)據(jù)使用Trimmomatic和Flash軟件進(jìn)行質(zhì)控拼接并去除低質(zhì)量堿基，拼接后數(shù)據(jù)利用Qiime(版本1.9.1，http:∥qiime.org/)軟件并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。使用UCLUST算法(http://drive5.com/usearch/manual/uclust_algo.html)以97%相似度并依照80%置信度使用RDP classifier對序列進(jìn)行OTU分類，采用Greengene數(shù)據(jù)庫對各OTU進(jìn)行物種信息注釋。根據(jù)OTU豐度使用STAMP軟件對不同樣本進(jìn)行主成分分析(PCA)。不同組之間差異物種通過LEfSe(linear discriminant analysis effect size)分析找出[11]，各樣本微生物代謝功能運用PICRUSt (phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)進(jìn)行功能預(yù)測[12]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

本文中數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±sem)，超過2組數(shù)據(jù)的組間顯著性差異由單因素方差分析(One-way ANOVA)，并進(jìn)行Turkey事后檢驗得出，p<0.05時認(rèn)為具有顯著性差異。顯著性差異分析由Graphpad Prism軟件(版本7.0)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 MOS對HFD小鼠體重的影響

高脂飲食導(dǎo)致小鼠增加了更多的體重。第11周時，HFD組小鼠體重增長率相比NC組小鼠出現(xiàn)極顯著升高(p<0.001)，而高脂飲食灌胃MOS后體重增長率出現(xiàn)顯著降低(p<0.05)；NC+MOS組小鼠體重增長率相比于NC組有下降，但沒有顯著性差異(表1)。

表1 不同飲食組小鼠體重及增長率Table 1 Body weights and weight gains of different diet groups

注：**：p<0.01，***：p<0.001，和NC組相比；#：p<0.05，###：p<0.001，和HFD組相比。

這表明甘露寡糖能夠減緩高脂飲食造成的體重增長，對正常飲食小鼠控制體重增長也有效果。因此，甘露寡糖可用于食品添加以控制體重的增長。

2.2 MOS對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

在確定MOS對高脂飲食小鼠控制體重增長具有明顯改善作用后，進(jìn)一步研究了MOS對高脂飲食小鼠的腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。對實驗最后1周時的小鼠糞便微生物進(jìn)行了16 s高通量測序，以研究不同組之間腸道菌群的變化。測序得到質(zhì)檢合格Reads共1 552 609條，各樣本中測序得到最小Reads數(shù)為50 266條，各樣本統(tǒng)一到此Reads數(shù)，按照97%相似度進(jìn)行OTU分類，得到3 843個OTU。在此測序深度上，各組樣本稀釋性曲線趨向于平穩(wěn)(圖1)，而香農(nóng)曲線則平坦穩(wěn)定(圖2)，由此可知，雖然在進(jìn)一步測序時仍會出現(xiàn)罕見的新型基因型，但大多數(shù)物種已經(jīng)被檢測到。

圖1 小鼠腸道微生物測序稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of gut microbiota in mice

對不同飲食組小鼠腸道微生物測序得到的OTU進(jìn)行主成分分析(PCA)。由PCA分析可以看出，不同飲食組的小鼠腸道菌群樣本被明顯分開(圖3)。PC1(占總方差的44.3%)可將高脂飲食組與正常飲食組樣本分開，PC2(占總方差的23.9%)又可以將添加MOS樣本與未添加MOS樣本分開。PCA分析顯示，不同飲食小鼠腸道微生物的整體結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化，添加MOS后可顯著調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，且對高脂飲食小鼠的腸道菌群調(diào)節(jié)尤為明顯。

圖3 基于OTU豐度矩陣的PCA分析Fig.3 PCA scores plot calculated with the OTU abundance matrix

2.3 MOS對不同小鼠腸道中特定微生物的調(diào)節(jié)

為尋找不同實驗組中豐度變化顯著的標(biāo)志微生物，運用LEfSe分析差異OTU。由于數(shù)據(jù)庫并不能注釋所有的OTU，因此，僅分析可以被數(shù)據(jù)庫注釋的微生物，不能被準(zhǔn)確注釋的微生物定義為上一級未分類微生物(Unclassified)。結(jié)果如圖4所示。在門水平上，HFD組同NC組相比，厚壁菌門(Firmicutes)豐度顯著升高，擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)豐度顯著降低；HFD+MOS組和HFD組相比，厚壁菌門(Firmicutes)和脫鐵桿菌門(Deferribacteres)豐度顯著降低，放線菌門(Actinobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)豐度顯著升高。而在屬水平上，HFD組同NC組相比，Dehalobacterium、Coprococcus、Roseburia、Ruminococcus和Flexispira豐度顯著升高，Bifidobacterium、Parabacteroides、Lactobacillus和Christensenella豐度顯著降低；HFD+MOS組和HFD組相比，Rhodococcus、Odoribacter、Mucispirillum、Turicibacter、Dehalobacterium、Coprococcus、Roseburia、Ruminococcus、Butyricicoccus和Oscillospira豐度顯著降低，Bifidobacterium、Alistipes、Christensenella、Anaerotruncus、Clostridium、Coprobacillus、Sutterella和Akkermansia豐度顯著升高。有關(guān)腸道菌群與肥胖等代謝疾病的關(guān)系研究日漸豐富，通過高通量測序技術(shù)得到了大量的菌群相關(guān)數(shù)據(jù)，通過益生元與益生菌干預(yù)腸道菌群來治療肥胖等代謝疾病的研究證明了一些特定的腸道微生物能夠起到預(yù)防及治療肥胖的作用[13-14]。例如Bifidobacterium是常見的益生菌，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用；Akkermansia則被認(rèn)為具有潛在的治療肥胖、糖尿病等代謝疾病的功效，被越來越多的學(xué)者所關(guān)注[15]；Mucispirillum、Roseburia、Ruminococcus、Clostridium、Alistipes等微生物也在不同的報道中所出現(xiàn)[13-15]。本研究通過高通量測序技術(shù)找到一些能夠被MOS所調(diào)控的腸道微生物，這些微生物可能在促進(jìn)或抑制肥胖上發(fā)揮重要作用。雖然還需要實驗進(jìn)行進(jìn)一步驗證，這些結(jié)果還是為MOS調(diào)節(jié)腸道微生物并抑制高脂飲食造成的小鼠肥胖提供了初步的證據(jù)。

圖4 不同飲食小鼠腸道中差異微生物分析Fig.4 Biomarkers of gut microbiome in different diets mice

2.4 MOS對高脂飲食小鼠腸道菌群代謝功能組成的影響

為了探究MOS對小鼠腸道微生物自身功能的影響，運用PICRUSt對腸道菌群的代謝功能進(jìn)行了預(yù)測(圖5)。首先在本研究中，小鼠腸道菌群代謝功能中氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、輔因子及維生素代謝、核酸代謝有較多基因被預(yù)測，其次是多糖生物合成及代謝和脂代謝等。同正常飲食小鼠相比，高脂飲食小鼠腸道菌群各種代謝預(yù)測基因占總代謝預(yù)測基因百分比相差不大，僅有氨基酸代謝、酶家族、脂代謝外源性化合物生物降解及代謝預(yù)測基因豐度略有升高，多糖生物合成及代謝預(yù)測基因豐度略有降低。灌胃MOS后，其他次級代謝物生物合成、多糖生物合成、代謝及脂代謝等預(yù)測基因占比升高。

圖5 不同飲食小鼠腸道菌群代謝分類功能預(yù)測Fig.5 Functional prediction of metabolism of gut microbiota in different diets mice

進(jìn)一步對脂代謝相關(guān)途徑基因進(jìn)行預(yù)測(圖6)。脂代謝途徑中脂肪酸生物合成、脂肪酸代謝、甘油脂代謝、甘油磷脂代謝、脂質(zhì)生物合成蛋白及鞘脂代謝基因被較多預(yù)測到。添加MOS能夠增強(qiáng)花生四烯酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、鞘脂代謝及類固醇激素生物合成等代謝預(yù)測基因的豐度，同時降低甘油脂代謝、脂質(zhì)生物合成蛋白等代謝預(yù)測基因的豐度。以上結(jié)果表明，灌胃MOS后能夠增強(qiáng)小鼠腸道菌群脂代謝及多糖生物合成及代謝等功能，這也印證了經(jīng)MOS干預(yù)能夠促進(jìn)小鼠腸道菌群脂質(zhì)及其他相關(guān)代謝的功能，有助于降脂減重。

圖6 不同飲食小鼠腸道菌群脂代謝途徑功能預(yù)測Fig.6 Functional prediction of lipid metabolism of gut microbiota in different diets mice

2.5 MOS對不同飲食小鼠盲腸中短鏈脂肪酸的影響

大部分的短鏈脂肪酸(SCFA)是在盲腸和近端結(jié)腸產(chǎn)生的[16]。為了探究MOS對正常及高脂飲食小鼠腸道產(chǎn)酸能力的影響，運用氣相色譜，檢測了不同飲食小鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的含量(圖7)。高脂飲食導(dǎo)致小鼠盲腸中戊酸含量顯著升高(p<0.05)，乙酸、丙酸、丁酸含量發(fā)生輕微變化，但并不顯著；灌胃MOS后，同HFD小鼠相比，乙酸(p<0.001)、丙酸(p<0.01)、丁酸(p<0.05)含量顯著升高，戊酸含量顯著降低(p<0.001)。腸道中的短鏈脂肪酸以乙酸、丙酸和丁酸為主，含量達(dá)到95%以上[17]。研究表明，這3種酸有助于減輕高脂飲食造成的體重增長[18]。乙酸、丙酸和丁酸還能夠通過調(diào)節(jié)宿主的能量攝取和消耗來控制體重[14]。因此，在本研究中MOS能夠顯著提高小鼠盲腸中乙酸、丙酸和丁酸的含量，進(jìn)而有助于控制高脂飲食小鼠的體重增長。由于戊酸在腸道中的含量較少，暫未發(fā)現(xiàn)有關(guān)戊酸與肥胖及相關(guān)能量代謝的研究。但在本研究中，高脂飲食導(dǎo)致小鼠盲腸中戊酸含量顯著增加，MOS又可以顯著降低高脂飲食小鼠中戊酸的含量，因此，腸道中戊酸含量的增加可能會加速肥胖的發(fā)展，這需要進(jìn)一步的研究加以驗證。MOS同樣能夠提高正常飲食小鼠盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸的含量，并降低戊酸的含量，表明MOS對正常小鼠同樣具有良好的保健效果。

圖7 小鼠盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量Fig.7 Concentrations of SCFAs in cecal content注：*：p <0.05，**：p<0.01，***：p<0.001

3 結(jié)論

MOS能夠降低小鼠由高脂飲食造成的體重增長；能夠改變高脂飲食小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)一些潛在的與肥胖相關(guān)微生物的豐度，促進(jìn)乳桿菌、雙歧桿菌、Akkermansia等益生菌的生長；能夠增強(qiáng)小鼠腸道菌群脂代謝及多糖生物合成及代謝等功能；同時，能夠調(diào)節(jié)小鼠盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸的含量，增加乙酸、丙酸、丁酸的含量，降低戊酸的含量。這些結(jié)果表明，MOS對高脂飲食造成的肥胖小鼠具有顯著的益生作用。