劉勇　史嘉翊　劉潔婷　柏合

【摘要】 目的：探究在大小鼠生物凈化中應(yīng)用生物工程技術(shù)的效果。方法：自2016年1月開(kāi)始，本研究中心選擇常用的C57BL/6J品系小鼠作為研究A組、選擇SD大鼠作為研究B組，在繁殖中應(yīng)用生物工程技術(shù)；另選擇一部分小鼠與大鼠作為對(duì)照A、B組，在其繁殖過(guò)程中不做任何干涉隨機(jī)。每組研究對(duì)象15只。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，對(duì)所有鼠的病原微生物進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用體外受精與胚胎移植的生物工程技術(shù)，在HTF培養(yǎng)液中完成受精并發(fā)育至2-細(xì)胞時(shí)期，將胚胎移植入購(gòu)買來(lái)并激素處理過(guò)的代孕SPF級(jí)ICR雌鼠的輸卵管中。代孕ICR雌鼠生下子代，子代3周離乳后，對(duì)代孕ICR雌鼠和隨機(jī)挑選的子代一只進(jìn)行檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)研究A、B組的采集卵子數(shù)、2-細(xì)胞數(shù)與移植胚胎數(shù)。統(tǒng)計(jì)四組研究對(duì)象的平均每胎產(chǎn)仔數(shù)、存活率。統(tǒng)計(jì)凈化前后四組研究對(duì)象的病原微生物檢出率及凈化率。結(jié)果：研究A、B組生物工程技術(shù)指標(biāo)（采集卵子數(shù)、2-細(xì)胞數(shù)與移植胚胎數(shù)）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；四組研究對(duì)象平均每胎產(chǎn)仔數(shù)與存活率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；四組研究對(duì)象在合籠與體外受精前，均尾靜脈取血進(jìn)行血霉菌培養(yǎng)。仔鼠出生3周離乳后，每胎隨機(jī)選一只與其代孕ICR母鼠一起進(jìn)行尾靜脈取血，進(jìn)行血霉菌培養(yǎng)，對(duì)照A、B組的凈化率均顯著低于研究A、B組（P<0.05）。結(jié)論：在小鼠大鼠的生物凈化中應(yīng)用體外受精與胚胎移植的生物工程技術(shù)，在不影響代孕母鼠的生殖能力與子代存活率的情況下，顯著地提升了凈化率，達(dá)到了研究的目的，從而能為臨床動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供更多優(yōu)質(zhì)可用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

【關(guān)鍵詞】 體外受精； 胚胎移植； C57BL/6J小鼠； SD大鼠； 病原微生物

Application and Clinical Value of Bioengineering Technology in Biological Purification of SPF Mice/LIU Yong，SHI Jiayi，LIU Jieting，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（27）：0-029

【Abstract】 Objective：To explore the application of bioengineering technology in biological purification of large and small mice.Method：Since January 2016，the research center selected the common C57BL/6J strain mice as the study group A and SD rats as the study group B，applied bioengineering techniques to the reproduction，and selected some mice and rats as the control A and B groups，and did not interfere random in their reproduction process.There were 15 subjects in each group.The pathogenic microorganisms of all rats were detected before the experiment.The bioengineering techniques used in vitro fertilization and embryo transfer were used to fertilize and develop into the 2-cells period in the HTF culture.The embryos were transplanted into the oviduct of the SPF grade ICR female rat of the surrogate， which was purchased and treated with hormone.The surrogate ICR female rats were born in the next generation.After three weeks of subgeneration，the surrogate ICR female rats and one offspring were randomly selected.The number of ovum collected，the number of 2-cells and the number of transplanted embryos in the study A and B groups were statistically analyzed.The average number of litter per litter and survival rate of the four groups were analyzed.The detection rate and purification rate of pathogenic microorganisms in four groups before and after statistical purification were statistically analyzed.Result：The biological engineering technical indexes（the number of egg collection，the number of 2-cells and the number of transplanted embryos） of the study A and B groups，there were no statistical significance（P>0.05）.The average number of births and survival rates and the survival rate of the four groups，there were no significant differences（P>0.05）.In the four groups，blood samples were taken from the tail vein before the cage and in vitro fertilization.After three weeks of birth，one of the offspring was randomly selected to take the tail vein with a surrogate ICR mouse to take blood from the tail vein to carry out the blood mold culture.The purification rate of the control A and B groups were significantly lower than those of the study A and B groups（P<0.05）.Conclusion：The bioengineering techniques for the application of in vitro fertilization and embryo transfer in the biological purification of the mice，without affecting the reproductive and progeny survival rate of the surrogate mouse，significantly improve the purification rate and reached the aim of the study，thus providing more quality and available experimental animals for clinical animal experiments.

【Key words】 In vitro fertilization； Embryo transfer； C57BL/6J mice； SD rats； Pathogenic microorganism

First-authors address：Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.27.007

C57BL/6J小鼠與SD大鼠是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，憑借其容易飼養(yǎng)和便于進(jìn)行遺傳學(xué)操作受到了廣大研究人員的青睞[1]。無(wú)特異病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)動(dòng)物，指的是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的機(jī)體內(nèi)不存在特定的微生物或寄生蟲(chóng)是國(guó)際公認(rèn)的健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用這種級(jí)別的動(dòng)物進(jìn)行研究操作，能夠?qū)⒓膊∨c一些病原微生物所造成的影響排除在外[2]。由于多種原因，例如從動(dòng)物中心購(gòu)買后的運(yùn)輸過(guò)程、實(shí)驗(yàn)室本身的安全級(jí)別較低，有可能會(huì)使應(yīng)該是無(wú)特定病原體級(jí)的小鼠與大鼠感染微生物，無(wú)法達(dá)到無(wú)特定病原體級(jí)的實(shí)驗(yàn)要求。在過(guò)去的時(shí)候，對(duì)小鼠大鼠進(jìn)行生物凈化，常用的是藥物處理，但這種方式的凈化率較為低下且成本高[3]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，有研究表明，胎盤的屏障作用能夠防止病原微生物從母體側(cè)進(jìn)入胎兒的體內(nèi)。研究人員利用此原理，大力發(fā)展體外受精與胚胎移植技術(shù)在生物凈化中的應(yīng)用[4]。為此，本院選擇部分病原微生物檢測(cè)不合格的C57BL/6J小鼠與SD大鼠，體外受精后將胚胎移植進(jìn)入代孕的無(wú)特定病原體的ICR小鼠體內(nèi)，以探究生物工程技術(shù)在生物凈化中的應(yīng)用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 自2016年1月開(kāi)始，本研究中心選擇常用的C57BL/6J品系小鼠作為研究A組、選擇SD大鼠作為研究B組，在繁殖中應(yīng)用生物工程技術(shù)；另選擇一部分小鼠與大鼠作為對(duì)照A、B組，在其繁殖過(guò)程中不做任何干涉隨機(jī)。每組研究對(duì)象

15只。納入標(biāo)準(zhǔn)；所選小鼠與大鼠均為8周大；取血樣進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果出現(xiàn)了下面五種病原菌的任意一種：金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌。排除標(biāo)準(zhǔn)：接種了同種或異種動(dòng)物的腫瘤組織。

1.2 方法

1.2.1 體外受精

1.2.1.1 應(yīng)用頸椎脫臼法處死雄性C57BL/6J小鼠與SD大鼠，剖開(kāi)腹腔，將兩側(cè)的睪丸與附睪取出，置于含HTF培養(yǎng)液的EP管中，在超凈工作臺(tái)中分離出附睪，將組織與血塊剔除后，將附睪放置于預(yù)先經(jīng)過(guò)平衡處理的HTF獲能液中處理2 h，以完成獲能[5]。

1.2.1.2 體外受精前3 d，對(duì)雌性C57BL/6J小鼠與SD大鼠進(jìn)行注射PMSG的處理（7.5 IU）。在48 h后，繼續(xù)對(duì)供卵的雌性注射7.5 IU的hCG。14 h后，經(jīng)過(guò)兩種激素處理過(guò)的雌鼠，頸椎脫臼處死，剖開(kāi)腹腔后將雙側(cè)輸卵管分離出來(lái)，置于預(yù)先經(jīng)過(guò)平衡處理的HTF培養(yǎng)液[6]，分離出卵團(tuán)。

1.2.1.3 選擇活力旺盛的精子，將其轉(zhuǎn)移進(jìn)入培養(yǎng)卵的培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，完成受精后洗滌受精卵。次日，選擇發(fā)育到2-細(xì)胞階段的胚胎進(jìn)行移植。

1.2.2 胚胎移植[7]

1.2.2.1 在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前兩周，對(duì)成熟的SPF級(jí)ICR雄鼠進(jìn)行結(jié)扎。將雄鼠用3%水合氯醛麻醉后，從睪丸處剪開(kāi)皮膚，找到輸精管，取一段約 3mm長(zhǎng)的組織，以保證輸精管完全斷開(kāi)。待結(jié)扎雄鼠恢復(fù)一周后，進(jìn)行試懷孕，以確定將殘存在輸精管中的精子排除干凈，方可進(jìn)行接下來(lái)的假孕操作。

1.2.2.2 將成熟的SPF級(jí)ICR雌鼠與結(jié)扎雄鼠以

2︰1的比例進(jìn)行合籠，次日上午8：00～9：00檢栓，見(jiàn)栓的雌鼠可以用來(lái)做胚胎移植的代孕母鼠[8]。

1.2.2.3 代孕母鼠用水合氯醛麻醉后，用酒精消毒后置于解剖鏡下，小鼠采取俯臥位，在肋骨下緣出剔除毛發(fā)，剪開(kāi)一個(gè)約5 mm的切口，找到脂肪墊后將卵巢與子宮一并牽引出體外[9]。固定后，在解剖鏡下確定輸卵管傘部的位置。用自制的移卵吸管吸取滿足移植要求的2-細(xì)胞胚胎，從輸卵管傘部的切口出將胚胎吹入。關(guān)腹。將代孕的ICR雌鼠放置在SPF級(jí)鼠房[10]，等待其生產(chǎn)。

1.2.3 新生仔鼠21 d離乳后，與其代孕母鼠，一同進(jìn)行尾靜脈取血，涂抹在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后，與細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比，以確定是否發(fā)生病原微生物的感染[11]。

1.3 觀察指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)研究A、B組的采集卵子數(shù)、2-細(xì)胞數(shù)與移植胚胎數(shù)。統(tǒng)計(jì)四組研究對(duì)象的平均每胎產(chǎn)仔數(shù)、存活率。代孕ICR雌鼠生下子代，子代3周離乳后，對(duì)代孕ICR雌鼠和隨機(jī)挑選的子代一只進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)凈化前后四組研究對(duì)象的病原微生物檢出率及凈化率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究A、B組的采集卵子數(shù)、2-細(xì)胞數(shù)與移植胚胎數(shù)的對(duì)比 研究A、B組生物工程技術(shù)指標(biāo)（采集卵子數(shù)、2-細(xì)胞數(shù)與移植胚胎數(shù)）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.2 四組研究對(duì)象平均每胎產(chǎn)仔數(shù)、存活率對(duì)比 對(duì)四組研究對(duì)象的平均每胎產(chǎn)仔數(shù)與存活率進(jìn)行分析，四組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

2.3 凈化前后四組研究對(duì)象的病原微生物檢出率及凈化率 四組研究對(duì)象在合籠與體外受精前，均尾靜脈取血進(jìn)行血霉菌培養(yǎng)。仔鼠出生3周離乳后，每胎隨機(jī)選一只與其代孕ICR母鼠一起進(jìn)行尾靜脈取血，進(jìn)行血霉菌培養(yǎng)即性成熟后，對(duì)照組的凈化率顯著低于研究組（P<0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

20世紀(jì)50～60年代，體外受精（in vitro fertilization，IVF）與胚胎移植（embryo transfer，ET）開(kāi)始起步[12]，經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展與進(jìn)步，在小鼠與大鼠中運(yùn)用這兩種技術(shù)已經(jīng)非常成熟并得以廣泛應(yīng)用，在基因敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建、生物凈化、克隆動(dòng)物的建立中具有相當(dāng)重要的作用[13]。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，最常用的就是SPF級(jí)動(dòng)物，這種動(dòng)物不僅能排除病原微生物對(duì)實(shí)驗(yàn)與結(jié)果的影響，還可以減少對(duì)一起飼養(yǎng)的同類與實(shí)驗(yàn)人員健康的不利影響[14]。SPF級(jí)動(dòng)物憑借其對(duì)飼養(yǎng)條件要求不高的特點(diǎn)受到了諸多研究人員的青睞，其中C57BL/6J小鼠與SD大鼠是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

通常在他處動(dòng)物中心購(gòu)買的小鼠大鼠，原實(shí)驗(yàn)室能夠保證動(dòng)物處于SPF級(jí)。由于多種原因，如從動(dòng)物中心購(gòu)買后的運(yùn)輸過(guò)程、實(shí)驗(yàn)室本身的安全級(jí)別較低，有可能會(huì)使應(yīng)該是無(wú)特定病原體級(jí)的小鼠與大鼠感染微生物，無(wú)法達(dá)到無(wú)特定病原體級(jí)的實(shí)驗(yàn)要求。在過(guò)去的時(shí)候，對(duì)小鼠大鼠進(jìn)行生物凈化，常用的是藥物處理，但這種方式的凈化率較為低下且成本高[15]。

隨著生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，有研究表明，胎盤的屏障作用能夠防止病原微生物從母體側(cè)進(jìn)入胎兒的體內(nèi)。研究人員利用此原理，大力發(fā)展體外受精與胚胎移植技術(shù)在生物凈化中的應(yīng)用[14]。為此，本院選擇部分病原微生物檢測(cè)不合格的C57BL/6J小鼠與SD大鼠，體外受精后將胚胎移植進(jìn)入代孕的SPF級(jí)ICR雌鼠內(nèi)，以探究生物工程技術(shù)在生物凈化中的應(yīng)用。

本研究中，將被微生物污染的雄性C57BL/6J小鼠與SD大鼠在實(shí)驗(yàn)室外處死后，取出儲(chǔ)存成熟精子的附睪，在超凈工作臺(tái)中分離出精子，在HTF培養(yǎng)液中使精子獲能[16]。對(duì)雄性進(jìn)行操作的同時(shí)，對(duì)同樣被污染的雌性C57BL/6J小鼠與SD大鼠，注射PMSG與hCG進(jìn)行超數(shù)排卵的操作，選擇形態(tài)與功能良好的卵團(tuán)與運(yùn)動(dòng)活躍的精子一同培養(yǎng)完成體外受精的操作。本研究中，應(yīng)用確定為SPF級(jí)ICR結(jié)扎雄鼠，與可孕的ICR雌鼠合籠誘導(dǎo)假孕，為接納體外發(fā)育至2-細(xì)胞時(shí)期的胚胎做好準(zhǔn)備[17]。

目前，應(yīng)用胚胎移植技術(shù)進(jìn)行生物凈化有兩種策略，第一種是雌鼠與雄鼠自然合籠交配，從雌鼠的子宮角中分離受精卵，然后移植到代孕雌鼠體內(nèi)。這種操作需要研究人員從一側(cè)子宮角注射生理鹽水將胚胎沖出，所獲得的胚胎數(shù)目較少，而且需要大量的雌鼠與雄鼠合籠，成本比較高[18]。為了提高凈化率的同時(shí)盡可能地降低成本，研究人員開(kāi)發(fā)出了生物凈化的第二種方法——超數(shù)排卵、體外受精與胚胎移植。這種操作方法只需要處死一只雄鼠，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量，使得凈化的速度得以加快，種群得以快速繁殖[19]。

本研究結(jié)果顯示，研究A、B組的生物工程技術(shù)指標(biāo)（采集卵子數(shù)、2-細(xì)胞數(shù)與移植胚胎數(shù)）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；四組研究對(duì)象平均每胎產(chǎn)仔數(shù)與存活率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這兩個(gè)數(shù)據(jù)說(shuō)明了生物工程技術(shù)對(duì)代孕母鼠的生育能力未產(chǎn)生影響，對(duì)子代的生存率與質(zhì)量未產(chǎn)生影響；四組研究對(duì)象在合籠與體外受精前，均尾靜脈取血進(jìn)行血霉菌培養(yǎng)。仔鼠出生3周離乳后，每胎隨機(jī)選一只與其代孕ICR母鼠一起進(jìn)行尾靜脈取血，進(jìn)行血霉菌培養(yǎng)，對(duì)照A、B組的凈化率均顯著低于研究A、B組（P<0.05）。

綜上所述，在大小鼠的生物凈化中應(yīng)用體外受精與胚胎移植的生物工程技術(shù)，在不影響代孕母鼠的生殖能力與子代存活率的情況下，顯著地提升了凈化率，達(dá)到了研究的目的，從而能為臨床動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供更多優(yōu)質(zhì)可用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在實(shí)際的研究工作中有較大的應(yīng)用價(jià)值。

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（收稿日期：2018-06-06） （本文編輯：程旭然）