廖夢姣，侯立朝，王志鑫，湯 鋒，王東旭，任 利，龐明泉，王海久，樊海寧*

(1.青海大學附屬醫(yī)院肝膽外科，青海 西寧 810001；2.青海大學高原醫(yī)學研究中心，青海 西寧 810001；3.青海省包蟲病重點實驗室，青海 西寧 810001)

Treg細胞參與維持機體的免疫平衡，具有免疫負向調(diào)控作用[1-3]，F(xiàn)oxp3是Treg細胞的標記物，但Foxp3是細胞核蛋白，限定了Treg細胞的分離，也阻礙了對Treg細胞功能的進一步研究[4]，在胃腸道疾病中發(fā)現(xiàn)CD127也是Treg細胞的表面標記物，其CD127在CD4+的細胞中呈高表達(CD4+CD127high)。但在CD4+CD25high的細胞中CD127呈低表達(即CD4+CD25+CD127low)，在CD4+CD25highCD127lowTreg細胞中檢測到大于90%的細胞表達Foxp3，并且CD4+CD25+CD127lowTreg細胞能抑制T細胞的增值和功能[5]，相關(guān)文獻報道過Treg細胞在泡型包蟲病中發(fā)揮作用[6]。但在泡型包蟲病中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞是否表達Foxp3，及其在泡型包蟲病的發(fā)展過程中存在何種意義，是否和CD4+CD25+Foxp3 Treg細胞一樣在泡球蚴感染中發(fā)揮免疫抑制作用，現(xiàn)有文獻未做闡述。本研究擬探討CD4+CD25+CD127lowTreg細胞中Foxp3的表達及CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg在泡球蚴感染中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級BALB/c雄性小鼠18只，體重(20±2)g，購于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場[許可證號：SCXK(蘇)2017-0001，NO.201722769]，隨機分成泡型包蟲病組、健康對照組。

1.1.2 實驗試劑、儀器

小鼠IFN-γ、IL-10、TGF-β1 ELISA試劑盒(Abcam公司)。抗體FITC Rat Anti-mouseCD4、PE Rat Anti-mouseCD25、APC Rat Anti-mouse CD127、BV421 Rat Anti-mouse Foxp3，同型對照FITCRat IgG2a、PE Rat IgG1、APC Rat IgG2b、BV421 Rat IgG2b，破膜液FIX/PERM(BD Biosciences公司)。小鼠淋巴細胞分離液(CEDARLANE公司)。青霉素-鏈霉素混合液(Gibco公司)。

5810R型離心機(Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 泡型包蟲病小鼠動物模型的建立

從感染泡球蚴的沙鼠腹腔中，在無菌條件下采集含泡球蚴的囊塊，在生理鹽水(含0.8×103U/mL青霉素和1mg/mL鏈霉素)中剪碎后，用300 μm的濾網(wǎng)過濾，收集下方的濾液，再用40 μm的濾網(wǎng)過濾，收集濾網(wǎng)上的泡球蚴，用生理鹽水(含0.8×103U/mL青霉素和1mg/mL鏈霉素)清洗數(shù)次，泡球蚴的成活率占95%以上(鏡下觀察)。

泡型包蟲病組(9只)：小鼠腹腔注射泡球蚴(生理鹽水將原頭蚴配成20%的濃度)200 μL。

健康對照組(9只)：小鼠腹腔注射生理鹽水200 μL。

1.2.2 CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+CD25+Foxp3 Treg細胞的檢測

動物模型建立3個月后，分別取泡型包蟲病組與健康對照組脾臟研磨，提取淋巴細胞，制成細胞懸液，將100 μL細胞懸液加入流式管，再加入FITC Rat Anti-mouse CD4 4 μL、PE Rat Anti-mouse CD25 10 μL、APC Rat Anti-mouse CD127 5 μL避光孵育20 min，同型對照加FITC Rat IgG2a 5 μL、PE Rat IgG1 5 μL、APCRat IgG2b 5 μL避光孵育20 min，加入破膜液FIX/PERM 500 μL 避光孵育30 min，離心(400g)5 min，棄上清液，加入1×Wash buffer 1 mL清洗，再次離心(400g)5 min，棄上清液，加入胞內(nèi)抗體BV421 Rat Anti-mouse Foxp3 5 μL，同型對照加BV421 Rat IgG2b 5 μL避光孵育30 min，離心(400g)5 min，棄上清液，加入1×Wash buffer 500 μL上流式細胞儀檢測CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+CD25+Foxp3 Treg及CD4+CD25+CD127lowTreg細胞中Foxp3的含量。

1.2.3 細胞因子的檢測

眼球采血收集小鼠血液，靜置4 h，離心(2500g)20 min，收集血清，用ELISA法測定泡型包蟲病組、健康對照組血清IFN-γ、IL-10、TGF-β1水平。

1.2.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 泡型包蟲病組病灶大小

將泡型包蟲病組小鼠處死，取出病灶測量大小，為(1.05±0.58)g。

2.2 健康對照組與泡型包蟲病組CD4+CD25+CD127low Treg、CD4+CD25+Foxp3 Treg細胞的含量

將小鼠脾臟研磨提取淋巴細胞后加入抗體上流式細胞儀檢測，健康對照組CD4+CD25+CD127lowTreg細胞為9.04±2.78，泡型包蟲病組為14.91±4.21(P<0.004 V.S.健康對照組)，健康對照組CD4+CD25+Foxp3Treg細胞為0.76±0.73，泡型包蟲病組為4.21±2.08(P<0.000V.S.健康對照組)(表1，圖1)。

表1健康對照組與泡型包蟲病組中CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+CD25+Foxp3Treg細胞的含量

Table 1 The content of CD4+CD25+CD127low Treg and CD4+CD25+Foxp3 Treg in the control group andalveolar echinocococosis group

A為健康對照組，B為泡型包蟲病組，C為健康對照組，D為泡型包蟲病組

圖1健康對照組與泡型包蟲病組中CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+CD25+Foxp3Treg細胞含量圖

Figure1ThecontentofCD4+CD25+CD127lowTregandCD4+CD25+Foxp3Tregincontrolgroupandalveolarechinocococosisgroup

2.3 CD4+CD25+CD127low Treg細胞中Foxp3的表達量

健康對照組與泡型包蟲病組脾淋巴細胞在P3門下檢測CD4+CD25+CD127lowTreg細胞中Foxp3的含量(圖1)，健康對照組中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞中Foxp3的含量為70.7%，泡型包蟲病組為67.7%，泡型包蟲病組與健康對照組中CD4+CD25+CD127lowTreg高表達Foxp3(圖2)。

A：健康對照組 B：實驗組

圖2健康對照組與泡型包蟲病組中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞中Foxp3的含量圖

Figure2Foxp3contentinCD4+CD25+CD127lowTregsincontrolgroupandalveolarechinocococosisgroup

2.4 泡型包蟲病組CD4+CD25+CD127low Treg細胞與病灶大小的相關(guān)性

泡型包蟲病組中脾淋巴細胞CD4+CD25+CD127lowTreg的含量與病灶大小進行Pearson相關(guān)性分析，兩指標呈正相關(guān)，r=0.894，P=0.01(圖3)。

圖3實驗組CD4+CD25+CD127lowTreg細胞與病灶大小相關(guān)性分析圖

Figure3CorrelationAnalysisbetweencontentofCD4+CD25+CD127lowTregandsizeoflesioninalveolarechinocococosisgroup

2.5 泡型包蟲病組CD4+CD25+Foxp3 Treg細胞與病灶大小的相關(guān)性

泡型包蟲病組中脾淋巴細胞CD4+CD25+Foxp3 Treg細胞的含量與病灶大小進行Pearson相關(guān)性分析，兩指標呈正相關(guān)，r=0.714，P=0.031(圖4)。

圖4實驗組CD4+CD25+Foxp3Treg細胞含量與病灶大小相關(guān)性分析圖

Figure4CorrelationanalysisbetweencontentofCD4+CD25+Foxp3TregandsizeoflesioninalveolarechinocococosisGroup

2.6 健康對照組與泡型包蟲病組血清IFN-γ、IL-10、TGF-β1的表達水平

健康對照組與泡型包蟲病組小鼠分別進行眼球采血，離心(2500g，20min)取血清行ELISA檢測，健康對照組IFN-γ為8.39±0.82，泡型包蟲病組為560.95±123.71(P<0.000V.S.健康對照組)。健康對照組IL-10為 538.52±55.82，泡型包蟲病組為1946.80±260.89(P<0.000V.S.健康對照組)。健康對照組TGF-β1為 223.90±56.34，泡型包蟲病組為 321.35±36.44(P<0.001V.S.健康對照組)(表2)。

表2泡型包蟲病組與健康對照組血清中IFN-γ、IL-10、TGF-β1的表達水平

Table 2 The levels of IFN-γ、IL-10、TGF-β1 in serum in alveolar echinocococosis group and control group

3 討論

本研究通過采用泡球蚴感染小鼠的動物模型觀察CD4+CD25+CD127lowTreg細胞對Foxp3的表達及CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg在感染泡球蚴小鼠中作用機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泡球蚴感染的小鼠刺激CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg細胞增殖，CD4+CD25+CD127lowTreg細胞高表達Foxp3，CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg細胞能促進泡型包蟲病的發(fā)展。

近幾年對Treg細胞的鑒別及特異性標記物一直都有爭議，活化標記物CD25不僅僅表達在Treg細胞上，也表達在活化的T細胞上。因此，不能通過CD25從活化的T細胞中區(qū)分出Treg細胞，CD25和Treg細胞的其他標記物如GITR、CTLA-4和CD45RB并不是在所有活化的CD4+細胞上都有表達[7-8]，近幾年Foxp3作為Treg的標記物。但其是核內(nèi)蛋白，限定了Treg細胞的體外分離及其進一步的功能研究，在胃腸道疾病中研究發(fā)現(xiàn)，通過表面標記物CD127聯(lián)合CD4+CD25+分離的CD4+CD25+CD127lowTreg細胞高表達Foxp3。并具有免疫抑制作用，其可作為Treg細胞的表面標記物[9]。本研究以小鼠動物模型為載體，觀察CD4+CD25+CD127lowTreg對Foxp3的表達，結(jié)果顯示，不管是健康小鼠還是泡型包蟲病小鼠CD4+CD25+CD127lowTreg細胞都高表達Foxp3，證實CD4+CD25+CD127lowTreg細胞在泡型包蟲病中也可作為Treg細胞的表面標記物。

Treg細胞可通過細胞間的接觸和分泌細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，通過與效應(yīng)性T細胞(Teff)的表面配體細胞毒性T細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)、可誘導共刺激因子(ICOS)和程序性死亡分子1(PD-1)結(jié)合，抑制Teff的功能[10]，從而降低機體的免疫功能。Treg細胞還可分泌TGF-β1、IL-10來發(fā)揮免疫抑制作用，TGF-β1抑制細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和Th1、Th2細胞的分化，同時促進外周Treg、Th17、Th9、Tfh細胞產(chǎn)生[11]。而白細胞介素(IL)-10是抑制抗原呈遞和促炎細胞因子釋放的調(diào)節(jié)性細胞因子[12]，我們實驗顯示泡球蚴感染的小鼠刺激CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg細胞增殖，同時顯示Treg細胞分泌的細胞因子(IFN-γ、IL-10和TGF-β1)顯著升高、CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg細胞含量與病灶的大小呈正相關(guān)。

綜上所述，我們可以初步推測：泡型包蟲病小鼠CD4+CD25+CD127lowTreg細胞高表達Foxp3，在泡型包蟲病中可作為Treg細胞的表面標記物；CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg細胞能促進泡型包蟲病的發(fā)展，同時初步揭示CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg細胞在泡型包蟲病的作用機制可能與抑制機體的免疫功能有關(guān)。

本實驗的樣本量少，并且機體免疫包括非特異性免疫和特異性免疫，它們之間并非孤立存在，而是存在密切的聯(lián)系。因此，對于泡型包蟲病的發(fā)病機制的研究，需要大量的、更深入的研究去闡明。