王瑞玲　劉雯霞　劉彩紅　郭蕊　王亞靜

【摘要】 目的：探討絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在尼古丁誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）自噬中的作用。方法：不同濃度尼古丁（6×10-9、6×10-8、6×10-7、6×10-6 mol/L）處理HUVECs，采用CCK-8和LDH試劑盒檢測(cè)尼古丁對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和活性的影響，運(yùn)用蛋白免疫印跡（Western blot）技術(shù)檢測(cè)尼古丁作用下Beclin-1和LC3Ⅱ的表達(dá)及ERK1/2、JNK、p38 MAPK的磷酸化水平。

結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，較高濃度尼古?。ā?×10-7 mol/L）抑制HUVECs的增殖能力（P<0.01），增加上清中LDH的活性（P<0.05），且在尼古丁濃度為6×10-6 mol/L時(shí)作用最明顯。與正常對(duì)照組相比，尼古丁（6×10-6 mol/L）作用下LC3Ⅱ表達(dá)顯著增加（P<0.01），而B(niǎo)eclin-1的表達(dá)減少（P<0.05）；同時(shí)尼古丁磷酸化MAPK信號(hào)，其中ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平分別增加了0.77倍和2.91倍（P<0.01），而JNK的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化。與尼古丁組相比，SB+尼古丁組中LC3Ⅱ與Beclin-1蛋白表達(dá)均增加（P<0.05）。結(jié)論：尼古丁可導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷并抑制細(xì)胞自噬，此過(guò)程中p38 MAPK信號(hào)通路可能起了重要作用。

【關(guān)鍵詞】 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 尼古?。?自噬； 心血管疾?。?MAPK

The Role of p38 MAPK Signaling Pathway in Nicotine-induced Vascular Endothelial Cells Autophagy/WANG Ruiling，LIU Wenxia，LIU Caihong，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（26）：0-045

【Abstract】 Objective：To investigate the differential role of mitogen-activated protein kinase（MAPK） pathway signaling in nicotine-induced vascular endothelial cells autophagy.Method：HUVECs were treated with different doses of nicotine（6×10-9，6×10-8，6×10-7，6×10-6 mol/L） .The effect of nicotine on the proliferation and activity of vascular endothelial cells was detected by CCK-8 and LDH kit.The protein expression level of Beclin-1 and LC3Ⅱand the phosphorylation of ERK1/2、p38 and JNK induced by nicotine were detected by Western blot.Result：Compared to the control group，the results indicated that higher doses of nicotine（≥6×10-7 mol/L） inhibited the ability of cell proliferation（P<0.01），and increased the activity of supernatant LDH （P<0.05），especially the 6×10-6 mol/L of nicotine had obvious effects.Compared with normal control group，nicotine（6×10-6 mol/L） significantly increased the LC3Ⅱ protein expression（P<0.01），while decreased the protein expression of Beclin-1（P<0.05）.Meanwhile，nicotine contributed to the phosphorylation of MAPK，among them，the phosphorylation of ERK1/2 and p38 MAPK increased by 0.77-fold and 2.91-fold（P<0.01），while the phosphorylation of JNK had no change.Compared to nicotine group， the LC3Ⅱand Beclin-1 protein expression of SB+nicotine group all increased（P<0.05）.Conclusion：Nicotine can damage human umbilical vein endothelial cells and inhibit autophagy，and p38 MAPK signaling pathway may play an important role in this process.

【Key words】 HUVECs； Nicotine； Autophagy； Cardiovascular disease； MAPK

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.26.010

心血管疾病死亡率居全球之首，而吸煙與心血管疾病有密切聯(lián)系[1]。香煙的主要成分尼古丁，可以影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、炎癥、血管再生及凋亡，從而引起血管內(nèi)皮功能紊亂[2]。但是，尼古丁引起血管內(nèi)皮功能紊亂的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。自噬是真核生物中進(jìn)化保守，降解多余、衰老或受損胞內(nèi)物質(zhì)的過(guò)程[3]。正常情況下很少發(fā)生自噬，但當(dāng)缺血缺氧、代謝壓力、蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤等情況下可誘發(fā)自噬[4-6]。此外，自噬生成或降解受阻時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞功能異常甚至受損及死亡[7]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞內(nèi)的重要傳遞者，目前有大量研究認(rèn)為MAPK信號(hào)家族在自噬各階段有重要作用[8-11]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究尼古丁對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性和自噬的影響，探討該過(guò)程中MAPK信號(hào)家族所起的重要作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）（中喬新舟，上海）；DMEM低糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液、青鏈霉素、Cell Counting Kit-8（CCK-8）細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒、β-actin抗體（博士德生物，武漢）；胎牛血清（浙江天杭生物，杭州）；乳酸酶脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒（南京建成生物，南京）；尼古?。⊿igma，美國(guó)）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物，上海）；LC3B（Sigma，美國(guó)）；Beclin-1、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、ERK1/2、p38、JNK抗體（CST，美國(guó)），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（中杉金橋生物，北京）；ECL發(fā)光液（愛(ài)必信生物，上海）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs，置于5%CO2、37 ℃

孵箱，待細(xì)胞融合至80%進(jìn)行不同濃度尼古丁（6×10-9、6×10-8、6×10-7、6×10-6 mol/L）處理24 h，6×10-6 mol/L尼古丁處理1 h或6 h，其中正常對(duì)照組不做尼古丁處理。每組處理樣本數(shù)為n=3，所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 將HUVECs接種于96孔板，密度為1×105/mL，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的尼古丁。按照Cell Counting Kit-8檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，孵育完成后用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各孔OD值。

1.2.3 LDH試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性 將HUVECs以1×106/mL密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合至80%，用不同濃度尼古丁處理后分別收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞。按照乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，之后用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各樣本的OD值，并根據(jù)公式計(jì)算各組上清中LDH的活力。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，融合至80%時(shí)分為兩組：正常對(duì)照組和尼古丁組（6×10-6mol/L）（根據(jù)尼古丁對(duì)細(xì)胞增殖能力和活性影響，確定的實(shí)驗(yàn)?zāi)峁哦〗K濃度），分別給予不同處理后提取細(xì)胞總蛋白。提取細(xì)胞總蛋白具體方法：棄培養(yǎng)上清后置于冰上，預(yù)冷PBS沖洗3次，加入配置好的細(xì)胞裂解液，待細(xì)胞裂解后收集于離心管超聲破碎及低溫離心，離心完畢后抽取上清并用BCA法測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度，根據(jù)上樣量制備蛋白樣本。95 ℃，5 min蛋白變性，制備12%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白質(zhì)，電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。待封閉完成，TBST洗膜3次，每次5 min。將膜置于蛋白相對(duì)應(yīng)的一抗稀釋液（1︰1 000）孵育，4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜

3次后，與一抗同源的二抗室溫?fù)u床孵育1 h。洗膜后即可用ECL發(fā)光液進(jìn)行壓片顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPPP 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料采用（x±s）表示。兩組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較則采用單因素方差分析（one-Way ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度尼古丁對(duì)HUVECs增殖能力的影響 不同濃度尼古丁處理HUVECs 24 h，尼古丁濃度≤6×10-8 mol/L時(shí)，細(xì)胞的增殖能力為（92.08±3.89）、（91.05±4.24），與正常對(duì)照組（99.00±0.87）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.292、0.121）；當(dāng)尼古丁濃度≥6×10-7 mol/L

時(shí)，細(xì)胞的增殖能力減弱，分別為（65.35±6.68）、（61.26±1.98），與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 0、0.000 0），且呈尼古丁劑量抑制依賴性關(guān)系，見(jiàn)圖1。

2.2 不同濃度尼古丁對(duì)HUVECs中LDH活力的影響 不同濃度尼古丁處理HUVECs 24 h，尼古丁濃度≤6×10-8 mol/L時(shí)，上清中LDH活力分別為（9.92±1.52）、（10.51±1.10），與正常對(duì)照組（8.82±0.83）相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.207、0.082）；當(dāng)尼古丁濃度≥6×10-7 mol/L時(shí)，上清中LDH活力呈尼古丁濃度依賴性增加，分別為（13.70±1.20）、（15.50±0.71），與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 0、0.000 0），見(jiàn)圖2。

2.3 尼古丁抑制HUVECs自噬 濃度為6×10-6 mol/L的尼古丁干預(yù)細(xì)胞6 h，與正常對(duì)照組相比，尼古丁組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)增加了1.41倍（1.33±0.12 vs 0.47±0.12，t=8.489，P=0.001），而此時(shí)Beclin-1蛋白表達(dá)卻減少了0.73倍（0.19±0.06 vs 0.33±0.02，t=4.013，P=0.016），見(jiàn)圖3。

2.4 尼古丁誘導(dǎo)MAPK磷酸化 與正常對(duì)照組相比，尼古丁處理1 h后MAPK信號(hào)家族成員中，ERK1/2、p38磷酸化水平均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而JNK的磷酸化水平并無(wú)明顯變化。其中，尼古丁組ERK1/2磷酸化水平（1.63±0.08）與對(duì)照組（0.92±0.11）相比增加了0.77倍（t=8.828，P=0.0009）；而尼古丁組p38 MAPK的磷酸化水平（2.42±0.16）與對(duì)照組（0.62±0.11）相比增加了2.91倍（t=17.96，P=0.000 1）。見(jiàn)圖4。

2.5 p38 MAPK抑制自噬的生成 p38 MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理HUVECs 30 min后給予尼古丁處理6 h。與尼古丁組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)（1.33±0.12）相比，SB+尼古丁組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加（1.65±0.10）（P=0.014）；與尼古丁組Beclin-1蛋白表達(dá)（0.11±0.03）相比，SB+尼古丁組的Beclin-1蛋白表達(dá)也進(jìn)一步增加（0.27±0.01）（P=0.007）。見(jiàn)圖5。

3 討論

吸煙是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素。香煙的主要成分尼古丁可以促進(jìn)心血管疾病發(fā)生[12-14]。尼古丁通過(guò)多種機(jī)制增加炎癥因子釋放、黏附分子的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂[15]；此外尼古丁還可以通過(guò)激活肥大細(xì)胞促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化疾病的進(jìn)展[16]，但是確切機(jī)制還不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)用尼古丁干預(yù)正常HUVECs，證實(shí)尼古丁作用下HUVECs增殖能力減弱且細(xì)胞膜受損，同時(shí)細(xì)胞自噬的生成受到抑制，而在該過(guò)程中p38 MAPK信號(hào)具有重要作用。

心血管疾病是由吸煙、高血壓等多種因素引起的一系列繼發(fā)性缺血性改變，而尼古丁可通過(guò)紊亂內(nèi)皮細(xì)胞功能從而促進(jìn)心血管疾病的發(fā)展[17]。已有多項(xiàng)研究表明，尼古丁可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活及增加細(xì)胞自噬[18]，而還有研究認(rèn)為尼古丁對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有毒性作用從而促進(jìn)細(xì)胞死亡[19]。這些爭(zhēng)議存在的原因可能是由于實(shí)驗(yàn)所用尼古丁濃度不同導(dǎo)致的。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的尼古?。?×10-9、6×10-8、6×10-7、6×10-6 mol/L）處理HUVECs，檢測(cè)尼古丁作用下細(xì)胞的增殖能力與損傷程度，以確定實(shí)驗(yàn)所用尼古丁終濃度。本研究發(fā)現(xiàn)，6×10-9、6×10-8 mol/L尼古丁濃度組內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力和培養(yǎng)上清LDH活性與正常對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而尼古丁濃度為6×10-7、6×10-6 mol/L時(shí)兩個(gè)指標(biāo)都發(fā)生了明顯變化，且呈尼古丁濃度依賴性。這提示較高濃度的尼古丁可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，破壞細(xì)胞膜的完整性，促進(jìn)細(xì)胞損傷。之前有報(bào)道發(fā)現(xiàn)尼古丁濃度低于

10-8 mol/L時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活，而高濃度尼古?。?gt;10-6 mol/L）則對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有損傷和毒性作用[20]，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致。因此，為了研究尼古丁對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制和損傷的機(jī)制，選用高濃度尼古丁（6×10-6 mol/L）做進(jìn)一步研究。

自噬（大自噬）過(guò)程主要包括自噬的生成和降解兩個(gè)階段：即自噬小體的形成與自噬小體和溶酶體融合降解。Beclin-1是哺乳動(dòng)物誘導(dǎo)自噬生成起始的基因，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3Ⅱ）則是自噬小體標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)中，尼古丁作用下Beclin-1蛋白表達(dá)減少，提示尼古丁作用下血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬生成水平下降；而LC3Ⅱ表達(dá)增多，這與自噬生成減少相矛盾，提示尼古丁還可能影響自噬的降解過(guò)程。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）主要分為3個(gè)亞族：ERK1/2、JNK、p38 MAPK通路是多種信號(hào)通路的中心，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、凋亡等多種生理反應(yīng)過(guò)程[21]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)家族在自噬的調(diào)控過(guò)程中有重要作用[8-11]，比如不同細(xì)胞類型和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境條件下，p38 MAPK對(duì)自噬有促進(jìn)或抑制作用[11，22]。本實(shí)驗(yàn)中，尼古丁作用下并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)JNK的磷酸化，而ERK1/2和p38 MAPK磷酸化增多，且p38 MAPK磷酸化水平增加更顯著。使用p38 MAPK抑制劑SB203580后可逆轉(zhuǎn)尼古丁作用下Beclin-1蛋白表達(dá)的減少，而此時(shí)LC3Ⅱ可能由于Beclin-1生成增多而增加。這提示MAPK家族成員p38 MAPK在尼古丁引起的自噬生成抑制環(huán)節(jié)中起重要作用，但是可能并不直接參與自噬的降解過(guò)程。此外，自噬的生成是否還與其他信號(hào)通路有關(guān)，以及自噬小體標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ蛋白增多的原因還有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步研究了尼古丁對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、活性及自噬的影響，且探討了MAPK在該過(guò)程中的作用，揭示了p38 MAPK在尼古丁引起的自噬生成抑制中有重要作用，而自噬生成抑制可能是細(xì)胞受損的原因之一?？傊狙芯繌臋C(jī)制方面為尼古丁引起的心血管疾病的治療提供了新思路。

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（收稿日期：2018-03-26） （本文編輯：張爽）