陳斌 許軼洲 周亮 楊建敏 葉顯華 童國新 黃進宇

心力衰竭主要分為射血分?jǐn)?shù)減少型心力衰竭及射血分?jǐn)?shù)保留型心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）。HFpEF 是左心室舒張功能受損但收縮功能正常的心力衰竭，目前無有效的治療措施，預(yù)后較差。甲羥戊酸途徑參與各種生命活動，也參與了多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HFpEF大鼠心肌組織甲羥戊酸途徑相關(guān)蛋白及下游活化的Ras蛋白表達升高，另外抑制甲羥戊酸途徑中的法尼基焦磷酸合成酶可改善HFpEF大鼠心肌重塑[1]。Ras蛋白為膜結(jié)合型三磷酸鳥苷酶，在心血管重塑方面發(fā)揮著重要作用，Ramos-Kuri等[2]通過基因工程敲除小鼠ras基因后，可減輕壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚。Ras蛋白的活化需要法尼基焦磷酸合成酶下游法尼基轉(zhuǎn)移酶（far-

nesyltransferase，F(xiàn)Tase）的法尼基化[3]，為進一步研究甲羥戊酸途徑在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的HFpEF的作用機制，本研究通過抑制FTase來觀察HFpEF心肌重構(gòu)情況，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 動物和藥品 選擇190～210g雄性清潔級SD大鼠30只，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，自由攝食飲水。FTI276（貨號：F9553）購自美國Sigma公司，G-LISA試劑盒購自美國Cytoskeleton公司，蘇木精染液、伊紅染液均購自谷歌生物，中性樹膠、二甲苯、無水乙醇均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗分組 采用隨機數(shù)字表法將雄性SD大鼠分為手術(shù)組、FTase抑制組（FTI組）及假手術(shù)組，每組10只，3組大鼠術(shù)前禁食24h，禁水12h。手術(shù)組：2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉，大鼠仰臥位固定于動物手術(shù)臺上，腹中線區(qū)剃毛、消毒、剪開腹壁，切口長度約3cm，暴露出腹主動脈，在發(fā)出右腎動脈上方5mm處，用手術(shù)線（4-0）把腹主動脈和兩端磨鈍的22G注射器針頭一起扎緊，拔出針頭，造成腹主動脈在結(jié)扎點處內(nèi)徑縮窄（腹主動脈在結(jié)扎點恢復(fù)再通后的內(nèi)徑為22G針頭外徑），小腸復(fù)位，關(guān)腹。FTI組：麻醉、暴露腹主動脈、腹主動縮窄等步驟同手術(shù)組，關(guān)腹后腹部皮下注射FTI276，每隔1d以300μg/kg持續(xù)注射8周。假手術(shù)組：麻醉及暴露腹主動脈同手術(shù)組，但不結(jié)扎腹主動脈，小腸復(fù)位，關(guān)腹。

1.3 觀察指標(biāo) （1）心臟超聲指標(biāo)：大鼠麻醉后，剃除胸部被毛、消毒，取左側(cè)臥位。M型超聲圖像長軸切面分別測量左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）和舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）；舒張末期室間隔厚度（IVSd）和左心室后壁厚度（LVPWd）；系統(tǒng)計算出左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（shortening fraction，F(xiàn)S）。采用脈沖多普勒經(jīng)心尖部四腔切面測量左心室早期充盈流入峰值速度（E峰）和晚期充盈流入峰值速度（A峰），由此計算出E/A比值。同時計算二尖瓣E峰減速時間（deceleration time，DT）。各指標(biāo)均在連續(xù)3個心動周期上測量取平均值。（2）血壓、左心室肥厚指數(shù)及Ras蛋白活性：采集完大鼠心臟超聲指標(biāo)第2天，麻醉大鼠并分離出右頸總動脈，將與壓力換能器及Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)連接的聚乙烯管插入右頸總動脈，采集收縮壓、舒張壓及左心室舒張末期壓力（LVEDP）。處死大鼠后取出心臟并分離出左心室稱重，計算左心室質(zhì)量與體重的比值（left ventricular weight/body weight，LVW/BW），剪取一部分左心室組織置于10%中性甲醛溶液固定24h，石蠟包埋，用于HE和Masson染色。酶標(biāo)儀在吸光度490nm處檢測左心室組織Ras蛋白活性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血壓及左心室指標(biāo)比較 見表1。

表1 3組大鼠血壓及左心室指標(biāo)比較

由表1可見，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組收縮壓與舒張壓明顯升高，左心室質(zhì)量及LVW/BW增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.01、16.11；10.91、6.18，均P＜0.01）。FTI組較手術(shù)組血壓無降低，但左心室質(zhì)量及LVW/BW均減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.23、-6.21，均P＜0.05）。

2.2 3組大鼠心臟超聲比較 3組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較見表2。3組大鼠左心室M型超聲比較見圖1。

由表2可見，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組IVSd與LVPWd均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.33、6.76，均P＜0.01）；與假手術(shù)組比較，手術(shù)組E/A比值明顯降低，DT明顯延長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.72、4.34，均P＜0.05）。與手術(shù)組比較，F(xiàn)TI組IVSd與LVPWd均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-3.48、-3.56，均P＜0.05）。由圖 1 可見，手術(shù)組IVSd、LVPWd 均較假手術(shù)組增厚，F(xiàn)TI組 IVSd、LVPWd較手術(shù)組降低。

表2 3組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較

圖1 3組左心室M型超聲比較（A：FTI組；B：手術(shù)組；C：假手術(shù)組。圖中虛線為測量線）

2.3 3組左心室心肌及左心室心肌內(nèi)血管的病理圖見圖2（見封三）。

圖2 3組左心室心肌及左心室心肌內(nèi)血管的病理圖（A：FTI組，H E染色，×400；B：手術(shù)組，H E染色，×400；C：假手術(shù)組，H E染色，×400；D：FTI組，M asson 染色，×400；E：手術(shù)組，M asson 染色，×400；F：假手術(shù)組，M asson 染色，×400）

通過計算3組左心室心肌細(xì)胞橫截面積發(fā)現(xiàn)：與假手術(shù)組比較，手術(shù)組心肌細(xì)胞橫截面積明顯變大[（304±21）μm2vs（409±34）μm2]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.26，P＜0.01），F(xiàn)TI組心肌細(xì)胞橫截面積（354±35）μm2較手術(shù)組（409±34）μm2變小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-3.76，P＜0.05）。另外，Masson染色發(fā)現(xiàn)腹主動脈縮窄可引起心肌內(nèi)血管周圍纖維化，而FTI276可改善血管周圍纖維化。

2.4 3組左心室心肌組織Ras蛋白活性比較 手術(shù)組左心室組織Ras蛋白活性[（0.632±0.064）nm]高于假手術(shù)組[（0.412±0.043）nm]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.76，P＜0.01），而FTI組Ras蛋白活性[（0.544±0.044）nm]較手術(shù)組[（0.632±0.064）nm]降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.23，P＜0.05）。

3 討論

高血壓是引起HFpEF的一個主要危險因素，高血壓患者中一半有左心室舒張功能障礙，基于高血壓的高發(fā)病率，探索高血壓導(dǎo)致的HFpEF迫在眉睫。

Ras蛋白是參與重要信號傳導(dǎo)通路的小G蛋白，這些蛋白存在于所有的真核生物，在一系列的生理過程中發(fā)揮著重要作用，如細(xì)胞增殖、分化及干細(xì)胞多能性[4]。研究發(fā)現(xiàn)Ras蛋白與許多心血管疾病相關(guān)[5]，抑制Ras蛋白后可減輕心肌肥厚，甚至可延緩代償性心肌肥厚到舒張功能障礙的轉(zhuǎn)變[6-7]。Ras蛋白轉(zhuǎn)錄后需要一系列的修飾才能與細(xì)胞膜結(jié)合，在這里Ras蛋白與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，從而激活下游的信號通路[8]。Ras蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的第一步也是最關(guān)鍵一步，是其羧基末端與法尼基的共價結(jié)合，即法尼基化，F(xiàn)Tase是胞質(zhì)內(nèi)Ras蛋白法尼基化的限速酶，且這個過程是不可逆的，法尼基化后的Ras蛋白才能與細(xì)胞膜結(jié)合，發(fā)揮活性作用[9-10]。因此抑制FTase可阻止Ras蛋白與細(xì)胞膜結(jié)合，從而抑制其激活的一序列信號通路。從細(xì)胞到動物模型，F(xiàn)Tase抑制劑在治療腫瘤已取得一定成效，部分FTase抑制劑已經(jīng)進行了臨床試驗[11-12]。

當(dāng)血壓升高時，左心室后負(fù)荷增加，為了維持恒定的室壁張力，心肌發(fā)生肥厚及纖維化，這是一個正常的生理調(diào)節(jié)過程。但如果壓力超負(fù)荷持續(xù)存在，則進展成病理性心室重構(gòu)，過度的心肌肥厚及纖維化將影響左心室舒張功能，最后導(dǎo)致舒張功能障礙[13]。部分研究發(fā)現(xiàn)HFpEF的嚴(yán)重程度和心肌纖維化成正比[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Tase抑制劑可直接引起心肌Ras蛋白活性下降，同時可改善心肌肥厚及纖維化，但并沒有引起血壓明顯下降。因此，我們推測，F(xiàn)Tase抑制劑是直接改善心肌肥厚和纖維化，而不是通過降低血壓來影響心肌重塑。本研究并未發(fā)現(xiàn)FTase抑制后左心室舒張功能得到改善，這可能有多方面的原因，筆者認(rèn)為藥物干預(yù)的時間不夠長可能是其中原因之一。

結(jié)合筆者以往及本次研究，我們可以推測Ras蛋白在大鼠壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的HFpEF中發(fā)揮著重要作用，而FTase抑制劑也許是治療HFpEF一個潛在的藥物。