云南省藥物研究所/云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心/云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111

我國是飲酒和釀酒的大國，已有幾千年歷史，形成了獨(dú)具特色的酒文化。適量飲酒可活血通絡(luò)、強(qiáng)心提神、消除疲勞和促進(jìn)睡眠等。然而，長期過量的飲酒可造成全身多器官的損傷，尤其是對(duì)胃腸道和肝臟損傷更為明顯，導(dǎo)致精神障礙、胃潰瘍、脂肪肝、酒精性肝炎以及肝硬化等疾病，嚴(yán)重者可因酒精過度抑制中樞系統(tǒng)而死亡。酒精依賴已然成為了當(dāng)今社會(huì)的焦點(diǎn)問題之一[1]。因此，嘗試和開發(fā)具有解酒功能的藥品或保健品，用來改善過量飲酒所帶來的眾多不適具有重要意義。酒久保甘飲植物飲料的前期研究提示，該飲料可能具有解酒護(hù)肝作用。本文在前期工作的基礎(chǔ)上，對(duì)酒久保甘飲植物飲料的解酒護(hù)肝作用進(jìn)行系統(tǒng)地研究，并初步探索其解酒護(hù)肝的作用機(jī)制，為該款功能飲料的后續(xù)開發(fā)研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料 酒久保甘飲植物飲料(棕色液體，批號(hào)：20130801，云南白藥天頤茶品有限公司)；海王牌金樽片(批號(hào)：20121112，杭州海王生物工程有限公司)；護(hù)肝片(批號(hào)：20130601，上?；氏箬F力藍(lán)天制藥有限公司)；56度紅星二鍋頭酒(批號(hào)：20130118、20130312，北京紅星股份有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào)：20131021)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào)：20131021)、考馬斯亮蘭試劑盒(批號(hào)：20131017)、谷胱甘肽(GSH)試劑盒(批號(hào)：20130914)、乙醇脫氫酶(ADH)試劑盒(批號(hào)：20131024)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒(批號(hào)：20130911)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒(批號(hào)：20130911)均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；甘油三酯(TG)試劑盒(批號(hào)：2013080010，浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司)。

1.2 儀器 AG285 METTLER TOLEDO電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；1500全波長酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems公司)。ZIL-2程控自主活動(dòng)箱(醫(yī)科院藥研所研制)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)KM小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002。

2 方法

2.1 小鼠防醉實(shí)驗(yàn)[2-3]KM種小鼠，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為5組，分別為模型對(duì)照組、海王金樽片組(3.0 g/kg)、酒久保甘飲植物飲料低劑量組(0.5倍原液)、酒久保甘飲植物飲料中劑量組(原液)和酒久保甘飲植物飲料高劑量組(2倍原液)，每組12只。各給藥組按照相應(yīng)劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)8 d，模型對(duì)照組灌胃等量的飲用水。末次給藥前要禁食不禁水12 h，末次給藥后30 min，各組小鼠均灌胃給予二鍋頭(16 mL/kg，由預(yù)試驗(yàn)得出)，以小鼠翻正反射消失作為醉酒指標(biāo)，記錄給酒時(shí)間，翻正反射消失時(shí)間及恢復(fù)時(shí)間，計(jì)算醉酒潛伏期(翻正反射消失時(shí)間-給酒時(shí)間)和醉酒時(shí)間(翻正反射恢復(fù)時(shí)間-翻正反射消失時(shí)間)。

2.2 對(duì)乙醇致小鼠平衡失調(diào)的影響 KM種小鼠，雄性，按體重隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、供試品組劑量及分組同上所述，每組12只。各給藥組按照相應(yīng)劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)5 d，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等量的飲用水。末次給藥后30 min，除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠均灌胃給予二鍋頭(14 mL/kg，由預(yù)試驗(yàn)得出)。然后將小鼠放在轉(zhuǎn)棒式疲勞儀的轉(zhuǎn)棒上，以一定速度迫使小鼠在棒上運(yùn)動(dòng)，記錄每只小鼠5 min內(nèi)的墜落次數(shù)和 1 h內(nèi)在轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間。

2.3 對(duì)乙醇致小鼠自主活動(dòng)減少的影響[4]KM種小鼠，雄性，實(shí)驗(yàn)分組同“對(duì)乙醇致小鼠平衡失調(diào)的影響”。各給藥組按照相應(yīng)劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)10 d，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等量的飲用水。末次給藥后30 min，除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠均灌胃給予二鍋頭(20 mL/kg，由預(yù)試驗(yàn)得出)，30 min后分別測(cè)定小鼠5 min內(nèi)自主活動(dòng)次數(shù)。

2.4 酒久保甘飲植物飲料的保肝作用研究[5-7]KM種小鼠，雄性，按體重隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、護(hù)肝片組(2.88 g/kg)、供試品組劑量及分組同上所述，每組15只。各給藥組按劑量每天上午灌胃1次，下午給予二鍋頭，連續(xù)46 d，正常對(duì)照組僅每天上午灌胃等量飲用水，模型對(duì)照組每天上午灌胃等量飲用水，下午給予二鍋頭。末次給藥后1 h，各組小鼠摘眼球采血并分離血清，測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活力。采血后脫頸椎處死小鼠，取出肝臟，按1∶10的重量體積比加入生理鹽水制備10%肝勻漿，離心取上清液，使用肝勻漿上清液按試劑盒說明書檢測(cè)乙醇脫氫酶(ADH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)和甘油三酯(TG)含量。

3 結(jié)果

3.1 小鼠防醉實(shí)驗(yàn) 由表1可知，與正常對(duì)照組比較，酒久保甘飲植物飲料高劑量組可以顯著縮短小鼠睡眠時(shí)間(P<0.05)。

表1 酒久保甘飲植物飲料對(duì)乙醇致小鼠醉酒的預(yù)防作用 ±s，n=12)

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05。

3.2 對(duì)乙醇致小鼠平衡失調(diào)的影響 由表2可知，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠5 min內(nèi)墜落次數(shù)顯著增多(P<0.01)，1 h內(nèi)平衡時(shí)間顯著減少(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，酒久保甘飲植物飲料高劑量組小鼠5 min內(nèi)墜落次數(shù)顯著減少(P<0.05)，1 h內(nèi)平衡時(shí)間明顯延長(P<0.05)。

表2 酒久保甘飲植物飲料對(duì)乙醇致小鼠平衡失調(diào)試驗(yàn)的影響 ±s，n=12)

注：與空白對(duì)照組比較，P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*P<0.05。

3.3 對(duì)乙醇致小鼠自主活動(dòng)減少的影響 由表3可知，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠5 min內(nèi)活動(dòng)次數(shù)顯著減少(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，酒久保甘飲植物飲料高劑量組小鼠5 min內(nèi)活動(dòng)次數(shù)顯著增加(P<0.05)。

表3 酒久保甘飲植物飲料對(duì)乙醇致小鼠自主活動(dòng)減少的影響 ±s，n=12)

注：與空白對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型對(duì)照組比較，*P<0.05。

3.4 酒久保甘飲植物飲料的保肝作用研究

3.4.1 對(duì)小鼠血清ALT和AST的影響 由表4可知，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清中的AST活性顯著升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，酒久保甘飲植物飲料中劑量組和高劑量組小鼠血清中AST活性顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表4 酒久保甘飲植物飲料對(duì)酒精肝損傷小鼠血清ALT和AST活性的影響 ±s，n=15)

注：與空白對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組對(duì)照比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4.2 對(duì)小鼠肝勻漿ADH和TG的影響 由表5可知，與模型對(duì)照組比較，酒久保甘飲植物飲料各劑量組小鼠肝勻漿中的TG含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，酒久保甘飲植物飲料高劑量組可以顯著提高乙醇脫氫酶的活性(P<0.01)。

表5 酒久保甘飲植物飲料對(duì)酒精肝損傷小鼠肝勻漿ADH和TG的影響 ±s，n=15)

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4.3 對(duì)小鼠肝勻漿SOD、MDA和GSH含量的影響 由表6可知，與模型對(duì)照組比較，酒久保甘飲植物飲料各劑量組小鼠肝勻漿中MDA含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，酒久保甘飲植物飲料低劑量和高劑量組小鼠肝勻漿中GSH顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

表6 酒久保甘飲植物飲料對(duì)小鼠肝勻漿SOD、MDA和GSH的影響 ±s，n=15)

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

酒精中毒俗稱醉酒，是指人飲用大量酒精后發(fā)生的機(jī)體功能異常情況，并能在短時(shí)間內(nèi)給患者帶來較大傷害，甚至可以間接或直接導(dǎo)致死亡。醉酒是酒精在體內(nèi)的吸收程度大于氧化代謝程度，過多的乙醇經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入大腦并作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，同時(shí)，酒精代謝生成的大量乙醛在體內(nèi)蓄積，從而產(chǎn)生明顯的醉酒反應(yīng)。長期酗酒可以引發(fā)酒精性肝病[8]，初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化。嚴(yán)重酗酒時(shí)可引發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死甚至誘發(fā)肝功能衰竭。

基于酒精在體內(nèi)吸收和代謝的特點(diǎn)，解酒[9]一方面應(yīng)降低酒精在消化道內(nèi)的吸收速度，增加在肝內(nèi)的代謝，增強(qiáng)肝臟內(nèi)ADH的活性，進(jìn)而加快乙醇在肝臟內(nèi)的代謝，快速緩解醉酒狀態(tài)；其次增強(qiáng)肝臟內(nèi)的乙醛脫氫酶(ALDH)的活性，減少乙醛在肝臟內(nèi)的蓄積，減輕乙醛對(duì)肝臟的細(xì)胞毒作用。另一方面應(yīng)提高肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)的活性，消除肝組織和血漿中的自由基和脂質(zhì)過氧化物，對(duì)肝臟起到保護(hù)作用，減輕酒精代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的損害。解酒制品的藥理作用核心就是降低血液中酒精的濃度及其代謝產(chǎn)物乙醛的濃度，減輕其對(duì)機(jī)體組織的損傷[10]。

在本研究中，通過小鼠防醉實(shí)驗(yàn)，乙醇致小鼠平衡失調(diào)實(shí)驗(yàn)和自主活動(dòng)減少實(shí)驗(yàn)，對(duì)酒久保甘飲植物飲料的解酒作用進(jìn)行了考察。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酒久保甘飲植物飲料可以顯著縮短小鼠醉酒后的睡眠時(shí)間，改善醉酒后的共濟(jì)失調(diào)和自主活動(dòng)減少等癥狀。提示酒久保甘飲植物飲料可能具有良好的解酒作用。隨后，建立了小鼠酒精性肝損傷模型，檢測(cè)了小鼠血清中的ALT和AST活性及小鼠肝勻漿中ADH、TG、SOD、MDA和GSH含量[11-12]。其中ALT和AST是臨床上用來判斷肝臟是否受損的檢測(cè)指標(biāo)，而TG是判斷酒精性脂肪肝的敏感指標(biāo)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酒久保甘飲植物飲料小鼠血清中的AST和肝勻漿中的TG水平均顯著降低，提示該飲料可能具有較好的保護(hù)肝臟作用。最后，我們?cè)谛∈缶凭愿螕p傷模型的基礎(chǔ)上，對(duì)酒久保甘飲植物飲料的解酒護(hù)肝機(jī)制進(jìn)行了探索性研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酒久保甘飲植物飲料小鼠肝勻漿中的MDA含量顯著降低，ADH的活性和GSH含量顯著升高，提示該飲料可能通過提高ADH活性和抗氧化作用從而達(dá)到解酒護(hù)肝作用。