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(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121013;2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048;3.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;4.榮成泰祥食品股份有限公司,山東榮成 264300;5.蓬萊京魯漁業(yè)有限公司,山東煙臺(tái) 265600;6.福建安井食品股份有限公司,福建廈門 361022)

“民以食為天,食以味為先”。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人民生活水平的提高,人們對(duì)美食、美味、營養(yǎng)、健康的追求越來越高。鮮味是人們飲食中努力追求的美味之一,它能使人產(chǎn)生舒服愉快的感覺。鮮味是一種復(fù)雜的綜合味感,我國將谷氨酸鈉、5′-鳥苷酸二鈉、天門冬酰胺酸鈉、琥珀酸二鈉、谷氨酸-親水性氨基酸二肽(或三肽)及水解蛋白的綜合味感均歸為鮮味[1]。鮮味物質(zhì)是能產(chǎn)生此種味感的物質(zhì),將其添加到食品中不僅能使食品鮮味增加,而且能增強(qiáng)食品的良好風(fēng)味,故歐美常將其稱為風(fēng)味增強(qiáng)劑(Flavor Enhancer)[2]。根據(jù)化學(xué)成分的不同,可將食品鮮味劑分為氨基酸類、核苷酸類、有機(jī)酸類、鮮味肽和復(fù)合鮮味劑等[3-4]。

肽是一種小分子的生物活性物質(zhì),除了具有生理活性外,還具備一定的功能特性,如降血壓、抗癌、抗菌、抗氧化和呈現(xiàn)風(fēng)味等[5-6]。其中,呈現(xiàn)風(fēng)味的一類食源性小分子肽被命名為呈味肽,根據(jù)肽呈現(xiàn)的味感,分為酸味肽、甜味肽、苦味肽、咸味肽和鮮味肽,某些呈味肽具有2種以上的滋味[7]。鮮味肽是一類新型活性肽類鮮味劑,作為一種可增強(qiáng)食物鮮味和醇厚味的呈味肽,具有良好的加工特性、呈鮮效果以及營養(yǎng)價(jià)值,符合“天然、營養(yǎng)、安全”的食品發(fā)展趨勢(shì),故成為近年來食品鮮味科學(xué)的研究熱點(diǎn)和鮮味劑開發(fā)的重點(diǎn)方向。

本文概述了食品中鮮味及鮮味物質(zhì)的研究現(xiàn)狀,重點(diǎn)介紹了鮮味肽的制備、分離純化和鑒定方法、構(gòu)效關(guān)系與呈鮮機(jī)制等方面的研究新進(jìn)展,并對(duì)研究中尚存在的問題進(jìn)行了討論,以期為鮮味調(diào)味品的開發(fā)、鮮味肽的研究利用、呈鮮機(jī)制的研究等提供理論依據(jù)和參考。

1 鮮味的研究現(xiàn)狀

鮮味在中國的飲食文化中影響深刻,是評(píng)價(jià)食品口感的一個(gè)重要因素。在中國關(guān)于鮮味的記錄最早可追溯至宋朝詩篇,到明朝鮮味的認(rèn)知已在民間普及[8]。現(xiàn)代鮮味的概念最早是由日本學(xué)者于1908年根據(jù)發(fā)現(xiàn)的類似谷氨酸鈉類物質(zhì)命名的,之后日本學(xué)者又相繼在食品中發(fā)現(xiàn)了核苷酸類和有機(jī)酸類鮮味物質(zhì),并將鮮味列為第五種基本味覺[3]。然而在歐美,鮮味不被承認(rèn)和接受,認(rèn)為谷氨酸鈉并沒有味道,只是可以增強(qiáng)食品風(fēng)味,是一種“風(fēng)味增強(qiáng)劑”。

基本味覺須遵循以下4點(diǎn)[9]:不是其他味覺的組合;在精神物理學(xué)和電生理學(xué)方面獨(dú)立于其他味覺;有特異性受體;對(duì)應(yīng)的味覺物質(zhì)普遍存在于食品中。1987年,Yamaguchi[10]對(duì)21種不同滋味刺激進(jìn)行研究,研究結(jié)果表明酸、甜、苦、咸4種基本味感位于四面體的頂點(diǎn),而鮮味則位于四面體頂點(diǎn)之外,為證實(shí)該模式，Ninomiya等[11]曾用谷氨酸一鈉(MSG)對(duì)小鼠的鼓索神經(jīng)進(jìn)行4種基本味覺的刺激試驗(yàn),研究發(fā)現(xiàn)MSG對(duì)NaCl、HCl、蔗糖、奎寧4種基本味并沒有提升味道的神經(jīng)活動(dòng)改變效應(yīng),確認(rèn)鮮味不是其他味覺的組合且不能增加4種味感的強(qiáng)度。鮮味是否是一種獨(dú)立的基本味覺取決于鮮味的受體性質(zhì),現(xiàn)在已知的鮮味受體有3種,分別為mGluR4、T1R1+T1R3和mGluR1[12-15]。它們都屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族(GPCRs)中的C族,mGluR1和mGluR4是味型代謝性谷氨酸受體,可接受谷氨酸和類似物的鮮味,T1R1+T1R3是由T1R味覺受體家族構(gòu)成的異源二聚體,它可接受各種成蛋白性L-氨基酸。它們是鮮味的特異性受體,由此認(rèn)為鮮味是一種獨(dú)立的基本味覺[16-17]。鮮味受體的多樣性使得不同鮮味物質(zhì)可以被識(shí)別分辨,從而也導(dǎo)致了鮮味的復(fù)雜性[7]。

鮮味的感知與基本味覺形成途徑相似,首先由呈味物質(zhì)刺激口腔味蕾上皮細(xì)胞中的味覺受體,然后通過味覺神經(jīng)將信號(hào)傳導(dǎo)至大腦的味覺中樞,最后通過大腦的綜合神經(jīng)中樞系統(tǒng)分析,產(chǎn)生味感[18]。鮮味是鮮味物質(zhì)與味覺細(xì)胞上的鮮味受體結(jié)合后產(chǎn)生的,但是鮮味受體的結(jié)構(gòu)與機(jī)制目前還未研究透徹,已知鮮味的感知可能涉及多個(gè)受體[19]。

鮮味不同于其他4種基本味覺,具有協(xié)同增效作用,當(dāng)兩種或多種不同類型的鮮味物質(zhì)混合后產(chǎn)生的鮮味，可能會(huì)大于單獨(dú)存在時(shí)所產(chǎn)生的鮮味之和。如MSG和5′-鳥苷酸二鈉(GMP)混合后鮮味強(qiáng)度增加,用MSG和GMP去刺激犬類的鼓索神經(jīng),GMP和低濃度的MSG都不會(huì)引起犬類鼓索神經(jīng)的反應(yīng),但當(dāng)兩者混合后,刺激強(qiáng)度會(huì)高于MSG和GMP反應(yīng)的總和,該協(xié)同反應(yīng)與人類相似[20]。這可能是因?yàn)镸SG和GMP所作用的受體位置不同,且前者的受體位置多于后者,當(dāng)G蛋白偶聯(lián)受體與GMP結(jié)合時(shí),產(chǎn)生了變構(gòu)現(xiàn)象,使隱蔽的味覺接收器暴露出來,從而更易于MSG結(jié)合,使鮮味增加[21]。為證明該協(xié)同作用是否由鈉離子引起,Nakamura等[22]在MSG和GMP的混合物中加入了NaCl的抑制劑,結(jié)果表明鮮味協(xié)同效應(yīng)不受抑制劑影響,證明鮮味的產(chǎn)生與鈉離子無關(guān)。

2 鮮味物質(zhì)的研究進(jìn)展

鮮味物質(zhì)為水溶性成分,當(dāng)其含量低于呈鮮閾值時(shí),只會(huì)對(duì)食品起到風(fēng)味增強(qiáng)的效果,只有當(dāng)含量高于呈鮮閾值時(shí),才能產(chǎn)生鮮味[23]。根據(jù)鮮味物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和特點(diǎn),可分為以下五類:氨基酸類、核苷酸類、有機(jī)酸類、復(fù)合鮮味劑和鮮味肽[18]。

2.1 氨基酸類

2.2 核苷酸類

據(jù)統(tǒng)計(jì),具有鮮味的核苷酸及其衍生物共有30多種。核苷酸有3種同分異構(gòu)體,2′,3′和5′,但是只有5′可以呈現(xiàn)鮮味,典型的呈鮮核苷酸類物質(zhì)有5′-肌苷酸二鈉(IMP)和5′-鳥苷酸二鈉(GMP),其與谷氨酸鈉類似,都是陰離子具有鮮味。IMP是1913年日本學(xué)家Kodama[27]從鰹魚干中提取的一種具有鮮味的活性物質(zhì),呈味閾值為0.025%,主要存在于動(dòng)物性食品中,尤其在干制食品中含量豐富。1957年,Kuninaka[28]發(fā)現(xiàn)GMP也具有鮮味,呈鮮閾值為0.0125%,隨后在香菇中發(fā)現(xiàn)了該物質(zhì),其主要存在于食用菌中。IMP是ATP的代謝產(chǎn)物,當(dāng)動(dòng)物死后,體內(nèi)的ATP降解成AMP,然后再進(jìn)一步降解為IMP,在死后10h,IMP的濃度含量會(huì)達(dá)到最高。GMP是RNA的代謝產(chǎn)物,在活細(xì)胞內(nèi),代謝并不會(huì)發(fā)生,只有當(dāng)細(xì)胞死后,核糖核酸酶才會(huì)與RNA結(jié)合產(chǎn)生GMP[9]。因鮮味顯著,IMP和GMP已商業(yè)化生產(chǎn),以其等質(zhì)量比例混合的I+G是目前市場(chǎng)上典型的鮮味劑之一,添加到食品中可增加肉類的原味,改善基本味感。

2.3 有機(jī)酸類

呈鮮的有機(jī)酸類主要有琥珀酸、沒食子酸、五倍子酸和乳酸[3]。琥珀酸及其鈉鹽主要存在于貝類和水產(chǎn)品中,是貝類特征滋味的主要成分之一,其中的琥珀酸二鈉最一種典型的呈鮮物質(zhì),已被廣泛應(yīng)用于各種食品中,其呈鮮閾值為0.03%[29]。乳酸也是水產(chǎn)品中的主要有機(jī)酸類物質(zhì),是魚貝類的特征滋味物質(zhì),對(duì)風(fēng)味有特殊貢獻(xiàn)作用[30-31]。沒食子酸和五倍子酸可以增加綠茶的鮮爽味,并且與谷氨酸產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),提高谷氨酸的鮮味強(qiáng)度[26]。琥珀酸二鈉是目前我國許可使用的有機(jī)酸鮮味劑,與谷氨酸和檸檬酸合用時(shí)會(huì)使鮮味增強(qiáng),它的生產(chǎn)包括合成法、發(fā)酵法和提取法[24]。

2.4 復(fù)合鮮味劑

復(fù)合鮮味劑是指由兩種及以上鮮味劑組合而成的復(fù)合物,根據(jù)來源可劃分為水解動(dòng)物蛋白、水解植物蛋白、酵母抽提物[32]。

水解動(dòng)物蛋白(HAP)是采用酶法或酸法把豬肉、牛肉、雞肉中的蛋白質(zhì)分解成含有多種氨基酸和肽類的水解液,再經(jīng)噴霧干燥而成粉狀的天然肉風(fēng)味調(diào)味料,可應(yīng)用于各種調(diào)味品,提高鮮味,產(chǎn)生肉香效果;也可應(yīng)用于香腸、牛肉、火腿、膨化食品等制品中,加強(qiáng)肉類天然味道,改進(jìn)香味,減少肉腥味,可降低生產(chǎn)成本[33]。HAP富含豐富的氨基酸和各種功能性多肽,具有多種生理活性功能,具有較好的加工品質(zhì),熱穩(wěn)定性高、水溶性好,品質(zhì)穩(wěn)定,適用于微波食品、冷凍食品和油炸食品等[34]。

水解植物蛋白(HVP)是植物性蛋白質(zhì)在酸或酶催化作用下水解后的產(chǎn)物,富含各種氨基酸和小肽,具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。在雞精、雞粉、雞汁、方便調(diào)料、湯料、肉制品、膨化食品中添加水解植物蛋白,可補(bǔ)充氨基酸、提高營養(yǎng)成份,且能起到增加鮮度、改善口感、掩蓋異味的作用,還可降低味精、I+G的使用量,提高產(chǎn)品檔次,降低成本。在肉味香精的生產(chǎn)中添加,可參與美拉德反應(yīng),提供反應(yīng)所需要的氨基酸,使反應(yīng)出的肉味香基更為純正,口感更為飽滿,也可做載體應(yīng)用[33]。傳統(tǒng)酸法生產(chǎn)的HVP會(huì)產(chǎn)生致癌物氯丙醇,對(duì)敏感氨基酸有破壞作用,而采用酶解法,條件溫和、不破壞敏感氨基酸,可保持原料風(fēng)味,并產(chǎn)生小分子肽,但是會(huì)受到成本較高、水解度較低的限制[35]。

酵母抽提物是以食品級(jí)的面包酵母或啤酒酵母為原料,通過自溶、酶解或酸解得到的復(fù)合鮮味劑[36]。它的主要成分是氨基酸和多肽,因此具有顯著的調(diào)味作用,可增加食品的營養(yǎng),強(qiáng)化食品風(fēng)味性能,掩蓋食品中的某些異味,具有健康天然、協(xié)調(diào)口感、鮮美醇厚、耐高溫等優(yōu)點(diǎn),被應(yīng)用于雞精、復(fù)合調(diào)味料等多種高檔調(diào)味料中[33]。

2.5 鮮味肽

以上鮮味物質(zhì)雖然鮮味強(qiáng)烈,但在調(diào)節(jié)風(fēng)味上也存在一些缺點(diǎn),如MSG的鮮味單一,單獨(dú)作為鮮味劑時(shí)適口性差,在口腔內(nèi)保留時(shí)間也較短;IMP和GMP食用較多后則會(huì)出現(xiàn)喉嚨干澀的現(xiàn)象;酶法制備水解蛋白成本較高、水解度低;酵母抽提物則有特殊酵母臭味,使得消費(fèi)者可接受性降低[36-37]。因此,亟須一種新型的鮮味替代品來解決以上問題,鮮味肽作為一種新型鮮味劑,鮮味顯著,具有較好的可口性和加工品質(zhì),而受到廣泛關(guān)注。具體的研究進(jìn)展如下。

3 鮮味肽的研究進(jìn)展

3.1 鮮味肽的來源

鮮味肽是能引起鮮味的一類小分子肽,可由食物中提取或經(jīng)氨基酸合成得到。Arai等[38]1972年從大豆蛋白水解產(chǎn)物中分離純化了3種二肽(Glu-Asp、Glu-Ser和Glu-Glu)和1種三肽(Glu-Gly-Ser),認(rèn)為這些肽具有肉湯的味道。Fujimaki等[39]1973年利用5種蛋白酶水解魚蛋白濃縮物,發(fā)現(xiàn)了有肉湯味和溫和后味的酸性小分子肽。Noguchi等[40]1975年從有類似MSG風(fēng)味的酶解液中共分離出4種二肽(Glu-Asp、Glu-Glu、Glu-Ser和Thr-Glu)和5種三肽(Asp-Glu-Ser、Glu-Asp-Glu、Glu-Gln-Glu、Glu-Gly-Ser和Ser-Glu-Glu),這些肽具有類似MSG的味道,但是均低于MSG的鮮味強(qiáng)度。Yamasaki等[41]1978年從用木瓜蛋白酶處理的牛肉中分離出一種八肽(Beefy Meaty Peptide,BMP),命名為鮮味肽(Umami Peptide),自此鮮味肽開始受到廣泛關(guān)注。

目前,在許多食品或食物中都發(fā)現(xiàn)含有鮮味肽,如動(dòng)物性食品中的牛肉、魚肉、貝類、雞湯、河豚等,植物性食品中的大米、大豆、小麥等,以及發(fā)酵食品中的醬油等。為了研究氨基酸組成和一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)鮮味肽活性的影響,合成了一些由鮮味氨基酸組成的二肽、三肽,以及不同一級(jí)結(jié)構(gòu)的BMP類似肽,其中的一些小分子肽類也具有鮮味[19]。文獻(xiàn)報(bào)道的不同來源和合成的鮮味肽及序列如表1所示。

表1 食品中鮮味肽的序列及來源及呈鮮閾值Table 1 Sequences,resources and threshold concentrations of umami peptides in food

續(xù)表

3.2 鮮味肽的特點(diǎn)

鮮味肽是鮮味物質(zhì)的重要組成部分,具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味活性,不僅能賦予食品美味的口感,增強(qiáng)食物鮮味和醇厚味,且能與其它物質(zhì)協(xié)同增鮮,可減少食鹽和MSG的攝入[7]。此外,鮮味肽還可以減弱苦味強(qiáng)度,具有良好的熱穩(wěn)定性。

研究發(fā)現(xiàn),鮮味肽除了本身具有鮮味外,還可以掩蓋和減弱苦味,改善食品的風(fēng)味。Kim等[65]用鮮味肽和苦味物質(zhì)(水楊苷)對(duì)表達(dá)苦味受體hTAS2R16的細(xì)胞進(jìn)行Ca2+流信號(hào)測(cè)定,以此研究鮮味和苦味間的相互作用,發(fā)現(xiàn)來源于大豆的5種典型鮮味肽(Glu-Asp,Glu-Glu,Glu-Ser,Asp-Glu-Ser和Glu-Gly-Ser)均可以明顯減弱水楊苷誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+流信號(hào),且它們的混合物以非競(jìng)爭(zhēng)方式影響Ca2+流信號(hào),其中Glu-Glu的抑制效果比hTAS2R16的特異性拮抗劑抑制效果更明顯,而無味肽(Gly-Gly)不會(huì)引起這種反應(yīng),結(jié)果表明鮮味肽可以通過苦味受體來減弱苦味。

鮮味肽具有良好的加工特性及熱穩(wěn)定性。Wang等[66]研究了BMP在 71 ℃、15 s巴氏殺菌和121 ℃、20 min蒸汽滅菌下的耐熱情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP在巴氏殺菌后的回收率為97.7%,蒸汽滅菌后的回收率為97.2%。BMP在高溫下的損失率小,可以滿足一般食品工業(yè)熱處理的要求。

3.3 鮮味肽的構(gòu)效關(guān)系與呈鮮機(jī)制

鮮味肽的構(gòu)效關(guān)系與呈鮮機(jī)制研究在學(xué)術(shù)界一直存在著很大的分歧。主要的爭(zhēng)議焦點(diǎn)聚集在:一是具備何種分子結(jié)構(gòu)的肽類化合物有鮮味,即鮮味肽結(jié)構(gòu)與鮮味之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,目前關(guān)于肽的空間構(gòu)象及氨基酸的構(gòu)型對(duì)鮮味影響的研究較少,尚未得出定論[67]。二是部分前人已鑒定出的鮮味肽,在后人的重復(fù)測(cè)定中并不呈現(xiàn)鮮味特征[19]。一些已經(jīng)鑒定出來的鮮味肽雖能呈現(xiàn)鮮味,但合成后經(jīng)過品評(píng),發(fā)現(xiàn)鮮味作用并不明顯甚至無鮮味。如Yamasaki等[41]合成的BMP除了鮮味之外,還有酸味和甜味,而Van Wassenaar等[68]和Tamura等[44]合成該肽后經(jīng)過品評(píng)發(fā)現(xiàn)并無鮮味,因此,鮮味肽的呈味機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

已有研究表明,鮮味肽的鮮味與其一級(jí)結(jié)構(gòu)和分子量等因素有關(guān)。鮮味肽通常都含有谷氨酸殘基或(和)天冬氨酸殘基,但也有例外。由相同氨基酸組成的不同肽會(huì)因?yàn)榘被嵝蛄胁煌a(chǎn)生不同的味道,相同氨基酸序列的肽也會(huì)因?yàn)闃?gòu)象不同而具有不同呈味特性[67]。此外,肽鏈的長度即肽的分子量大小也會(huì)影響肽的呈味特性,一般具有鮮味的肽的分子量在1kU以下。鮮味肽的酸性和堿性部分是其產(chǎn)生鮮味的主體部分,同時(shí)具備帶正電基團(tuán)、帶負(fù)電基團(tuán)和疏水基團(tuán),并且分別連接到對(duì)應(yīng)的感受器上,才能產(chǎn)生鮮味,對(duì)其與受體的關(guān)系也尚未明確,可能涉及多個(gè)受體[69]。目前已發(fā)現(xiàn)的主要鮮味受體包括異源二聚體T1R1/T1R3與味型代謝性谷氨酸受體mGluR1、mGluR4三種。它們都屬于GPCRs的C亞族,在結(jié)構(gòu)上的共同點(diǎn)是胞外有類似捕蠅草形狀的被稱作配體結(jié)合域的結(jié)構(gòu)域[12]。研究者通過基因敲除實(shí)驗(yàn)確定了鮮味受體T1R1/T1R3是感受鮮味的主要受體,味型代謝性谷氨酸受體mGluR4也參與鮮味響應(yīng),作為候選鮮味受體[70]。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的高速發(fā)展,已有應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助手段研究蛋白受體與配體相互作用的相關(guān)報(bào)道[71],為分析鮮味受體與鮮味肽之間的作用關(guān)系提供借鑒。Dang等[72]利用分子對(duì)接的方法研究鮮味二肽與鮮味受體之間的關(guān)系;Yu等[73]利用分子模擬手段研究了T1R1/T1R3 鮮味受體與不同結(jié)構(gòu)的鮮味六肽分子的結(jié)合特征,并且構(gòu)建了鮮味六肽的3D-QSAR模型。此外,Zhang等[74]利用分子模擬構(gòu)建了T1R1的空間構(gòu)象,借此研究鮮味受體與鮮味物質(zhì)的結(jié)合機(jī)制。這些研究為解釋鮮味肽的呈鮮機(jī)制提供了一定的依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

3.4 鮮味肽與其他鮮味物質(zhì)的協(xié)同作用

目前對(duì)鮮味肽與其他物質(zhì)的相互作用的研究主要集中在以下三點(diǎn):肽與肽、肽與核苷酸、肽與陽離子,鮮味肽與這三者之間都存在鮮味協(xié)同效應(yīng)。Tamura等[44]將鮮味二肽Lys-Gly與具有其他味道的四種多肽混合,產(chǎn)生了類似BMP的強(qiáng)烈鮮味,說明鮮味肽與其他多肽間存在相互作用。無鮮味或有微弱鮮味的一些肽與IMP混合后,會(huì)呈現(xiàn)鮮味或鮮味增強(qiáng),表明鮮味肽與IMP有鮮味協(xié)同作用。在Maehashi等[45]的研究中發(fā)現(xiàn),鮮味二肽Glu-Val與0.2% IMP混合后鮮味增強(qiáng),無鮮味的一些三肽如Ala-Asp-Glu、Ala-Glu-Asp、Asp-Glu-Glu、Ser-Pro-Glu和Glu-Glu-Asn在與0.2% IMP混合后鮮味提升。Park等[75]從魚露中分離鑒定出17種肽,并用固相或液相合成法合成了這些二肽、三肽和四肽,無鹽下表現(xiàn)出苦味、酸味、鮮味和無味,加入0.3%的NaCl后幾乎所有的多肽都具有咸鮮味。

3.5 鮮味肽的制備和鑒定方法

3.5.1 鮮味肽的制備 目前呈味肽的制備方法主要有提取法和蛋白降解法,提取的方法主要有微波、超聲波等,蛋白降解的方法主要有化學(xué)水解法和生物酶解法,相比于提取法和化學(xué)降解,生物酶解因具有以下優(yōu)點(diǎn):安全高效、過程可控、條件溫和、肽得率高,而得到廣泛應(yīng)用[76-77]。肖如武[29]采用復(fù)合酶水解藍(lán)蛤肉得到的酶解液甜鮮味突出,腥味和苦味較弱,肽得率較高,且鮮味肽富集的分子量區(qū)域比例高。在實(shí)際生產(chǎn)中,酶解法容易產(chǎn)生苦味肽等其他副產(chǎn)物,影響產(chǎn)品口感,因此采用合成方法生產(chǎn)鮮味肽正逐漸受到重視,如化學(xué)合成法和生物合成法[6]。

通過比較提取的天然鮮味肽和人工合成鮮味肽的味道,發(fā)現(xiàn)部分人工合成的鮮味肽味道發(fā)生了變化,且肽的分子量越大,這種趨勢(shì)越明顯[19]。如二肽Glu-Asp,Noguchi等[40]從魚蛋白酶解液中分離出的二肽具有類似MSG的味道,而Tamura等[44]合成的這個(gè)二肽的味道為咸味和鮮味。Yamasaki等[41]從牛肉中分離的八肽具有鮮味,而合成的八肽有除了鮮味之外,還有酸味和甜味。Van Wassenaar等[68]通過化學(xué)合成法再次驗(yàn)證該肽的呈味效果時(shí),卻得出該肽根本無鮮味的結(jié)論。Zhang等[19]分析了可能導(dǎo)致的原因:一是鮮味肽的制備方法可能影響肽的分析;二是肽的同分異構(gòu)體也會(huì)影響肽的風(fēng)味;三是空間結(jié)構(gòu)的不同干擾鮮味分析;四是鮮味肽與其他鮮味物質(zhì)的反應(yīng)會(huì)影響味覺評(píng)估。采用化學(xué)合成法制備鮮味肽可能會(huì)導(dǎo)致其呈鮮效果出現(xiàn)爭(zhēng)議,并且化學(xué)合成法成本較高,工序繁瑣,不適用于商業(yè)化生產(chǎn),因此鮮味肽的生物合成法愈發(fā)受到廣泛關(guān)注。

生物合成法是將含有目的基因的DNA片段經(jīng)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞或?qū)⑼庠椿虿迦胧删w基因序列中進(jìn)行表達(dá),再經(jīng)過加工純化后得到目標(biāo)活性肽的過程[69]。此法具有專一性強(qiáng)、取材廣泛、產(chǎn)量可觀等優(yōu)點(diǎn)。王艷萍等[78]利用畢赤酵母高效表達(dá)了牛肉風(fēng)味肽,通過實(shí)驗(yàn)最終獲得目的產(chǎn)物16拷貝的BMP。張崟等[79]根據(jù)大腸桿菌E.coliBL21(DE3)的密碼子偏愛性,設(shè)計(jì)了該鮮味八肽Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala的DNA 序列,并將其克隆在pET-32a(+)上形成表達(dá)載體。通過菌落PCR 檢測(cè)陽性克隆、重組質(zhì)粒鑒定及工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn),鮮味八肽的目的基因成功重組在pET-32a 載體上,所得pET-32a 鮮味肽重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后能夠正常表達(dá)融合蛋白,為后續(xù)獲得生物源鮮味八肽奠定了基礎(chǔ)。

3.5.2 鮮味肽的分離純化 利用目前的制備方法得到的鮮味肽并不是單一組分,通常摻雜其他混合組分,要想獲得單一組分的鮮味肽,需要對(duì)其進(jìn)行分離純化。并在逐級(jí)純化的過程中進(jìn)行鮮味值的測(cè)定分析,收集鮮味值高的組分進(jìn)行純化。目前鮮味肽的分離純化方法主要有超濾法、凝膠過濾法、大孔樹脂吸附法和高效液相色譜法等。超濾法和凝膠過濾法根據(jù)分子量大小不同對(duì)溶液進(jìn)行初步分離,得到分子量大小不同的各個(gè)組分。大孔樹脂吸附法是利用大孔樹脂物理性吸附和解吸有機(jī)物質(zhì)的能力,達(dá)到初步分離的目的。從初步分離得到的組分中篩選出具有鮮味的組分,利用高效液相色譜法進(jìn)一步分離純化,得到具有鮮味肽的組分。

林萌莉[76]取雞湯微濾后,分別用截留分子量為10、5、3 kU的超濾離心管超濾離心,得到四個(gè)組分,其中小于3 kU的組分和原雞湯味道相似。Zhuang等[80]研究了SP-825、HP-20、XAD-16和HP-2MGL四種大孔樹脂對(duì)醬油中鮮味肽的分離純化作用,可知XAD-16對(duì)肽具有較好的吸附率和解吸率,是富集鮮味肽效果最好的樹脂,并且用蒸餾水洗脫得到的組分鮮味效果最為突出。Zhuang等[54]采用中壓液相制備色譜(MPLC)和反相高效液相色譜(RP-HPLC)對(duì)從醬油中初步分離后的肽進(jìn)行再次分離純化,得到5種新型呈味肽,并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定,合成后確定其中的3種肽具有鮮味。

3.5.3 鮮味肽的鑒定 目前小分子肽的鑒定方法運(yùn)用最廣泛的是質(zhì)譜法,質(zhì)譜法是利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將運(yùn)動(dòng)的離子按它們的質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測(cè)的方法,現(xiàn)在多是將液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用,達(dá)到高效分離、鑒定的目的[53]。Dang等[56]采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對(duì)金華火腿和巴馬火腿水提液中的鮮味肽進(jìn)行鑒定,氨基酸序列分別為CCNKSV和AHSVRFY,合成后兩種肽的味道都有類似火腿的味道。都榮強(qiáng)等[64]通過MALDI-TOF-MS和LC-MS/MS的分析初步確認(rèn)了豬肉蛋白酶解液中質(zhì)荷比1198.7084和1790.8937的鮮味肽的序列分別為DAEDIVTPKP和STELPDGEVITIQER。劉源等[60]利用MALDI-TOF-MS測(cè)定了養(yǎng)殖暗紋東方鲀肌肉中具有鮮味和濃厚感的小分子肽,其序列為Pro-A-Ala-B-Met*-Cys-Arg(A和B均為氨基酸代碼,Met*表示氧化型甲硫氨酸)。

4 展望

鮮味是影響食品風(fēng)味評(píng)判的一個(gè)重要因素,鮮味物質(zhì)的開發(fā)是食品風(fēng)味化學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。鮮味肽作為一種新型天然鮮味劑,日益受到人們的關(guān)注和研究。隨著調(diào)味品市場(chǎng)的快速發(fā)展和調(diào)味品行業(yè)的不斷升級(jí),鮮味肽也勢(shì)必會(huì)得到廣泛應(yīng)用。但是目前國內(nèi)對(duì)鮮味肽的開發(fā)尚處于初步階段,且都停留在實(shí)驗(yàn)室階段,鮮味肽的制備技術(shù)尚未成熟,尤其是利用生物工程技術(shù)高效生產(chǎn)鮮味肽仍亟待發(fā)展,鮮味肽的呈鮮機(jī)制、鮮味肽與鮮味受體的構(gòu)效關(guān)系仍亟待進(jìn)一步完善。

我國低值水產(chǎn)品及加工副產(chǎn)物是天然肽類的重要前體物質(zhì),但目前資源利用率不高,大量低值原料和副產(chǎn)物被直接廢棄,造成了巨大的資源浪費(fèi)和嚴(yán)重的環(huán)境污染?？茖W(xué)利用這些資源,采用酶工程和基因工程等技術(shù)生產(chǎn)天然生物型鮮味肽,提高產(chǎn)品得率和穩(wěn)定性,是實(shí)現(xiàn)鮮味肽產(chǎn)業(yè)化的重要途徑之一。

此外,現(xiàn)有傳統(tǒng)鮮味肽的篩選具有一定盲目性,很難真正做到定向篩選。利用計(jì)算機(jī)輔助手段揭示鮮味肽與受體蛋白的相互作用機(jī)制,通過在線酶解軟件對(duì)蛋白進(jìn)行虛擬酶解以構(gòu)建鮮味多肽庫,利用分子對(duì)接構(gòu)建鮮味肽模型以篩選新型鮮味肽,通過基因工程生物合成鮮味肽,將成為鮮味肽定向研究的重要方向。