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(1.浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院,浙江杭州 310014;2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所,浙江溫州 325005;3.加拿大紀(jì)念大學(xué)工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院,加拿大 A1C5S7)

鼠尾藻(Sargassumthunbergii)是一種大型海藻,鼠尾藻組分中的鼠尾藻多酚具有較強的抗氧化活性,結(jié)構(gòu)特殊、具有生物活性和醫(yī)藥價值的天然海洋生物活性化合物,但因其含量少、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不易純化等諸多問題,使提取分離純化此類化合物成了一大難題。國內(nèi)外目前多是對其抑菌、神經(jīng)保護等性能進行試驗研究[1-3],缺乏面向工業(yè)化開發(fā)的探索,這也致使市場上到目前為止還沒有鼠尾藻多酚的產(chǎn)品。

目前提取分離鼠尾藻多酚的方法還是以傳統(tǒng)浸提、微波輔助和索式回流法為主[4-6]。傳統(tǒng)方法雖然操作簡單,技術(shù)較為成熟,但是有機溶劑消耗量大,提取時間長,提取率不高。大孔吸附樹脂由于其具有理化性質(zhì)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、再生處理方便等諸多優(yōu)點,越來越多地應(yīng)用于植物多酚提取分離。如Samee Haider等[7]則通過比較三種不同柱填料(大孔樹脂、硅膠、聚乙烯吡咯烷酮)對軟葉馬尾藻多酚的吸附性能,得出大孔吸附樹脂的吸附及解吸性能最佳,可得到的軟葉馬尾藻純度為62.43%。劉曉麗等[8]通過5種大孔吸附樹脂(XDA-1、LSA-10、H103、S-8、AB-8)對海帶多酚的吸附性能比較,發(fā)現(xiàn)XDA-1大孔吸附樹脂表現(xiàn)出較好的吸附性能與解吸效果,優(yōu)化條件下可得到純度為80.5%的海帶多酚。馮進等[9]用非極性HPD400樹脂吸附較弱極性的藍(lán)莓葉多酚,經(jīng)過HPD400樹脂的純化,藍(lán)莓葉多酚的純度由原來的38.75%提高到69.38%。

已有的研究表明,大孔吸附樹脂在分離多酚的領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景?；谑笪苍宥喾訉儆跇O性物質(zhì),根據(jù)相似相溶的原理,結(jié)合對常用大孔吸附樹脂的主要參數(shù)分析[10-11],在大孔吸附樹脂對親水性酚類衍生物吸附作用的研究[12-13],以及多種適用于多酚提取的樹脂篩分[14-15]等工作基礎(chǔ)上,本實驗采用XDA-1B大孔吸附樹脂來對鼠尾藻多酚進行吸附研究,探索得到適于鼠尾藻多酚分離純化的大孔吸附樹脂及優(yōu)化的分離提純參數(shù),并對其吸附及解吸動力學(xué)和等溫吸附進行考察。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠尾藻 采自浙江省溫州水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所洞頭基地;XDA-1B大孔吸附樹脂 鄭州勤實科技有限公司;鎢酸鈉、鉬酸鈉、沒食子酸(3,4,5-三羥基苯甲酸) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;濃磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、液溴乙醚、無水碳酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、無水乙酸鈉等 均為分析純。

HY-6雙層調(diào)速多用振蕩器、SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器 金壇市江南儀器廠;中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;UV-3200PCS紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司;智能磁力加熱攪拌器 SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 LZB-2常規(guī)型玻璃轉(zhuǎn)子流量計 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 鼠尾藻的預(yù)處理 取已曬干的鼠尾藻藻體頂部,用自來水沖洗干凈,除去附生生物和泥土等雜質(zhì),放入烘箱110 ℃充分烘干,然后用中草藥粉碎機將其粉碎,將粉碎后的鼠尾藻藻粉過80目篩裝入袋中,密封保存。

取適量上述藻粉于250 mL錐形瓶中,然后加入體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液過量,置搖床上轉(zhuǎn)速150 r/min常溫提取12 h。將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾除去乙醇,得到鼠尾藻多酚粗提物。

1.2.2 鼠尾藻粗提物紅外光譜測定 采用傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)測定樣品的表面官能團信息。掃描條件:KBr壓片,分辨率4 cm-1,4000～400 cm-1掃描。分析測試前樣品進行真空干燥處理,110 ℃干燥12 h。

1.2.3 大孔吸附樹脂預(yù)處理 XDA-1B大孔吸附樹脂做吸附實驗前需要進行預(yù)處理,先將XDA-1B大孔吸附樹脂用無水乙醇室溫下密封浸泡24 h,蒸餾水洗后再用5%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸溶液浸泡8 h,水洗至中性,再用5% 氫氧化鈉溶液浸泡8 h,水洗至中性,備用。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 參考GB/T 8313-2008,選用沒食子酸對多酚含量進行測定。分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 0.1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液于7個50 mL容量瓶中,各加30 mL蒸餾水,搖勻。加入2.5 mL FC試劑充分搖勻。1 min之后,加入7.5 mL 20%碳酸鈉溶液,混勻定容。水浴75 ℃下反應(yīng)10 min,冷卻至室溫。即得0、1、2、3、4、5、6 μg/mL的沒食子酸溶液。

取適量0、2 μg/mL的沒食子酸溶液于比色皿中,0 μg/mL沒食子酸溶液作為空白對照組,用紫外-可見分光光度計在680～800 nm波長之間測定2 μg/mL沒食子酸溶液的吸光度,取其吸光度最大的波長為最佳吸收波長為760 nm,分別取適量不同濃度的沒食子酸溶液于比色皿中測定,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程為y=0.0773x+0.0028(R2=0.9985)。

1.2.5 XDA-1B大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附和解吸的動力學(xué)特性測定 稱取0.5 g 已預(yù)處理的XDA-1B大孔吸附樹脂三份,分別置于100 mL錐形瓶中,各加入50 mL鼠尾藻多酚粗提物,水浴搖床30 ℃,轉(zhuǎn)速150 r/min下振蕩吸附。每隔1 h取0.5 mL粗提物懸清液于50 mL容量瓶中,再各加入30 mL蒸餾水,搖勻,再各加入2.5 mL FC(福林)試劑,7.5 mL 20% 碳酸鈉溶液,混勻定容。水浴75 ℃下反應(yīng)10 min,冷卻后,分別取適量于比色皿中,將其與空白組于最佳吸收波長760 nm下比色,測定其吸光度,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出鼠尾藻多酚濃度,取其平均值。再按公式(1、2)計算出每個時段的吸附量Q(mg/g),以Q對時間t(h)作圖,得樹脂對鼠尾藻多酚的吸附動力學(xué)曲線。

上述溶液吸附平衡后,抽濾,洗滌兩次,取樹脂分別置于3個100 mL錐形瓶中,各加入80 mL 80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇,水浴搖床30 ℃下振蕩解吸。每隔1 h取0.5 mL溶液于50 mL容量瓶中,再各加入30 mL蒸餾水,搖勻,各加入2.5 mL FC試劑,7.5 mL 20% 碳酸鈉溶液,混勻定容。水浴75 ℃下反應(yīng)10 min,冷卻后,分別取適量于比色皿中,將其與空白組于最佳吸收波長760 nm下比色,測定其吸光度,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出鼠尾藻多酚濃度,取其平均值。

根據(jù)測定的結(jié)果,按下式計算XDA-1B大孔吸附樹脂的吸附量及解吸率:

式(1)

式(2)

式中:Q為樹脂吸附量,(mg/g);C0為鼠尾藻多酚初始濃度,(mg/mL);C1濾液中鼠尾藻多酚的濃度,(mg/mL);V1為濾液體積,(mL);C2為洗脫液鼠尾藻多酚濃度,(mg/mL);V2為洗脫液體積,mL;W為大孔樹脂濕重,(g);ζ為解吸率(%)。

1.2.6 XDA-1B大孔吸附樹脂等溫吸附曲線的測定 分別稱取0.5 g XDA-1B大孔吸附樹脂于6個100 mL錐形瓶中,各加入濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的鼠尾藻多酚水溶液50 mL,置于轉(zhuǎn)速150 r/min水浴搖床,在不同溫度(20、30、40、50 ℃)下振蕩吸附3 h后,然后各取1 mL于50 mL容量瓶中,再各加入30 mL蒸餾水,搖勻,再各加入2.5 mL FC試劑,7.5 mL 20% 碳酸鈉溶液,混勻定容。水浴75 ℃下反應(yīng)10 min,冷卻后,分別取適量于比色皿中,將其與空白組于最佳吸收波長760 nm下比色,測定其吸光度,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出鼠尾藻多酚濃度,取其平均值,再按公式(1、2)計算出每個時段的吸附量Qe(mg/g),以Qe對多酚吸附平衡濃度Ce作圖,得樹脂對鼠尾藻多酚的等溫吸附曲線,得到的實驗數(shù)據(jù)用Langmuir和Freundlich模型擬合。

Langmuir吸附等溫式:

式(3)

Freundlich吸附經(jīng)驗公式:

lnQe=nlnce+lnKF

式(4)

式中:Qe-平衡吸附容量,mg/g;Qm-單分子層吸附達(dá)到飽和時對應(yīng)的吸附容量,mg/g;Ce-吸附平衡濃度,mg/mL;KL-Langmuir吸附平衡常數(shù),mL/mg;KF-Freundlich吸附平衡常數(shù),mL/mg;n-常數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 粗提物中多酚類物質(zhì)的紅外光譜檢測

鼠尾藻粗提物固體的紅外光譜圖,如圖1所示。在大致3300 cm-1和1250 cm-1有特征峰,這分別代表酚中-OH和C-O的伸縮振動,說明該粗提物中含有多酚物質(zhì)[16]。另外,2926.5 cm-1處特征峰代表了-CH2-的不對稱伸縮振動,1618.5 cm-1和1416 cm-1兩個特征峰代表了-CH3的彎曲振動,1078.6 cm-1代表了C-O-C醚鍵的一個伸縮振動,而圖1中兩個小于1000 cm-1的特征峰則表示碳碳雙鍵面外的一個彎曲振動。

圖1 鼠尾藻多酚粗提物紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum of crudeextract of Sargassum thunbergii polyphenol

2.2 XDA-1B大孔吸附樹脂吸附及解吸動力學(xué)

XDB-1A大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附及解吸動力學(xué)曲線見圖2。鼠尾藻多酚初始濃度為2.5 mg/mL時,XDB-1A大孔吸附樹脂在0～2 h之間,對鼠尾藻多酚的吸附速率較快,2 h之后趨向飽和吸附量81.0 mg/g,而且趨于平衡狀態(tài),說明XDA-1B大孔吸附樹脂對鼠尾藻多酚的吸附時間較短。上樣流速2.0 mL/min,洗脫流速2.0 mL/min條件下,XDA-1B對鼠尾藻多酚的解吸速率較快,2 h之后趨向飽和解吸率,而且趨于平衡狀態(tài),XDA-1B大孔吸附樹脂對鼠尾藻多酚的解吸時間較短,突顯出了柱層析法分離鼠尾藻多酚快捷高效的優(yōu)點。

圖2 XDA-1B大孔吸附樹脂對鼠尾藻多酚的靜態(tài)吸附及吸動力學(xué)曲線Fig.2 Static adsorption and desorption kineticscurves of XDA-1B on Sargassum thunbergii polyphenol

2.3 XDA-1B大孔吸附樹脂的等溫吸附

不同溫度下XDA-1B大孔吸附樹脂對鼠尾藻多酚的等溫吸附曲線見圖3。Langmuir和Frendlich等溫吸附方程擬合得到的相關(guān)參數(shù)見表1,計算得到的四個溫度下飽和吸附量為185、270、156、140 mg/g,呈現(xiàn)一個先上升后下降的趨勢,所以30 ℃是最適合XDA-1B大孔吸附樹脂吸附鼠尾藻多酚的溫度。在各個溫度下,當(dāng)粗提物多酚初始濃度增加到一定數(shù)值后,吸附量反而降低,說明鼠尾藻多酚濃度不是越高越好。

圖3 XDA-1B大孔吸附樹脂對鼠尾藻多酚的等溫吸附曲線Fig.3 Adsorption isotherm of Sargassum thunbergii polyphenols onto XDA-1B at different temperatures

擬合得到的模型參數(shù)列于表1,從表1 的數(shù)據(jù)可以看出,XDA-1B大孔吸附樹脂對鼠尾藻多酚的等溫吸附曲線比較符合Freundlich方程。在各個溫度下,Freundlich方程的回歸系數(shù)均大于Langmuir方程回歸系數(shù),Freundlich方程的回歸系數(shù)均在0.9以上,Freundlich吸附經(jīng)驗公式進行擬合比較合適。Langmuir和Freundlich吸附等溫式都可以用來描述單分子層吸附,可以判斷在30 ℃下,XDA-1B大孔吸附樹脂對鼠尾藻多酚的吸附都是單分子層吸附。XDA-1B大孔吸附樹脂的Freundlich模型中的常數(shù)n均介于0～1之間,屬于“優(yōu)惠吸附”[17-18],說明鼠尾藻多酚在XDA-1B大孔吸附樹脂上的吸附還是比較容易實現(xiàn)的。

3 結(jié)論

采用XDA-1B大孔吸附樹脂柱層析法對鼠尾藻多酚吸附解析條件進行探討,表明XDA-1B大孔吸附樹脂適用于鼠尾藻多酚分離純化,當(dāng)樣品溶液中鼠尾藻多酚初始濃度為2.5 mg/mL時,溫度為30 ℃時,XDA-1B大孔吸附樹脂對鼠尾藻多酚的靜態(tài)吸附量是最大的,飽和吸附量81.0 mg/g;上樣流速2.0 mL/min,洗脫流速2.0 mL/min條件下,鼠尾藻多酚的吸附和解吸速率較快,2 h之后均完成吸附和解吸。