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(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

甘薯是我國主要的糧食作物之一,種植面積大總產(chǎn)量高,加工產(chǎn)品種類多數(shù)量大。甘薯渣是經(jīng)提取淀粉或其他加工處理后的副產(chǎn)物,約占甘薯加工產(chǎn)量的20%～37%[1]。甘薯渣水分含量高,不易保存,既給生產(chǎn)帶來負(fù)擔(dān),又給環(huán)境帶來壓力。甘薯渣除富含膳食纖維之外,還含有其他活性物質(zhì),比如多酚、果膠、低聚麥芽糖等。去氫表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)是甘薯和山藥里特有的活性物質(zhì),其化學(xué)名為3β-羥基雄甾-5烯-17酮,化學(xué)結(jié)構(gòu)以甾體為母體外接一個(gè)芳雜環(huán)[2],近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其生理及藥理作用進(jìn)行了大量研究[3],表明其具有抗衰老[4]、抗腫瘤[5]、抗菌[6]、抑制肥胖[7-9]、增強(qiáng)記憶[10-11]、抗神經(jīng)炎癥[12]、調(diào)節(jié)人體激素[13-14]以及抑制卵細(xì)胞凋亡[15]的作用。人體血漿中含有DHEA,常以硫酸酯DHEAS的形式參與血液循環(huán),在酶的作用下轉(zhuǎn)化為雄性激素睪酮或雌酮[15],但人體DHEA水平隨著年齡的增長而下降,目前市面已有含DHEA的保健品或食品[16]。

去氫表雄酮來源較少,多為化學(xué)合成,但有較大副作用和毒性,也可利用毛霉、白色鏈霉菌等經(jīng)生物轉(zhuǎn)化得到,但生物轉(zhuǎn)化不僅過程復(fù)雜而且產(chǎn)物較多不易提純,故不是最佳獲得DHEA的途徑。部分天然植物如山藥、甘薯[16]中發(fā)現(xiàn)含有去氫表雄酮,因此可考慮從植物中獲取天然的DHEA。目前關(guān)于去氫表雄酮對(duì)常見致病菌及物生物的抑菌活性的研究較少。

因此,本文以甘薯渣為原料,通過提取甘薯渣中去氫表雄酮,初步探討去氫表雄酮對(duì)常見致病菌及其他微生物的抗菌活性,可為甘薯渣及去氫表雄酮的深度利用開發(fā)新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘薯渣 由復(fù)元生物公司提供;硫酸、氯化鋇、丙酮、二氯甲烷、無水硫酸鈉、醋酸鈉、碳酸鈉等 均為國產(chǎn)分析純;馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、炭疽桿菌、沙門氏菌、金黃葡萄球菌、鼠李糖乳桿菌 河南科技學(xué)院食品學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[17](用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌):0.5%牛肉膏,1%蛋白胨,0.5%氯化鈉,蒸餾水1000 mL,pH7.0～7.2,2%瓊脂;LB培養(yǎng)基[18](用于培養(yǎng)炭疽桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌):1%蛋白胨,0.5%酵母浸粉,1%氯化鈉,蒸餾水1000 mL,pH7.0～7.2,2%瓊脂;MRS培養(yǎng)基[19](用于培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌):0.5%蛋白胨,0.5%牛肉膏,1%胰蛋白胨,0.5%酵母浸粉,1%葡萄糖,1 mL吐溫80,0.2%磷酸氫二鉀,0.5%乙酸鈉;YPD培養(yǎng)基[20](用于培養(yǎng)馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母):2%葡萄糖,2%蛋白胨,1%酵母浸粉,蒸餾水1000 mL,pH7.0～7.2,2%瓊脂。

CW-2000型超聲波-微波協(xié)同萃取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司;TU-1810型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊儀器有限公司;SW-CJ-1D型單人單面垂直凈化工作臺(tái) 蘇州智華精密儀器有限公司;SIGMA3-30K型離心機(jī) 德國SIGMA公司;ALPHA 2-4 LSC型真空冷凍干燥箱 德國CHRIST公司;S-570型掃描電鏡 日本日立公司;SW22.SW23型恒溫振蕩水浴鍋 德國JULABO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甘薯渣中DHEA的提取 DHEA的提取方法參照文獻(xiàn)[21-23]的方法,略有修改,提取工藝如下:甘薯渣在45 ℃烘干磨粉后過200目篩備用,取100 g渣粉加3倍的水在37 ℃下預(yù)發(fā)酵24 h,用超聲波-微波協(xié)同萃取儀萃取,萃取的微波功率為300 W,萃取溫度為30 ℃,萃取時(shí)間為30 min;以6∶4的比例向萃取后的甘薯渣中加入30 mL甲醇-丙酮混合液,放置在45 ℃的水浴鍋中水浴30 min后用孔徑為80～120 μm,直徑為D 15 cm的濾紙過濾,收集的濾液經(jīng)真空冷凍干燥,收集干燥后的提取樣,在20 ℃、300 W下用10 mL甲醇超聲波洗脫30 min,向洗脫液里加100 mL醋酸鈉緩沖溶液,再超聲處理15 min,加入二氯甲烷萃取(萃取3次,每次間隔30 min,每次加入量為25 mL),收集萃取液并向其中加30 mL pH為6.8的碳酸鈉緩沖溶液,去水層,用無水硫酸鈉脫水,在-80 ℃經(jīng)真空冷凍干燥,收集干燥品。

1.2.2 甘薯渣DHEA的純化和高效液相分析 冷凍干燥膜分離:冷凍干燥品溶于色譜甲醇,依次用5、1.2和0.45 μm微濾膜除去DHEA提取液中的固形物來降低對(duì)超濾膜的污染,再依次通過分子量截留值為3000 Da的聚醚砜濾膜,之后濃縮、冷凍干燥后用色譜甲醇溶解,再利用制備液相進(jìn)行單體純化:色譜柱Diamonsil C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);檢測(cè)波長:218 nm;流動(dòng)相配比:甲醇-水=80-20;柱溫:30 ℃;流速:0.8 mL/min。配制DHEA標(biāo)準(zhǔn)液的濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL,進(jìn)樣量20 μL,繪制DHEA的標(biāo)準(zhǔn)曲線,橫坐標(biāo)為DHEA濃度,縱坐標(biāo)為峰面積。收集純化后的單體采用HPLC方法對(duì)甘薯渣中DHEA進(jìn)行定性定量分析。具體檢測(cè)方法為:Diamonsil C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);檢測(cè)波長 218 nm;流速0.6 mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量 20 μL;流動(dòng)相A(100%色譜甲醇)和流動(dòng)相B(超純水)。樣品峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比,按照峰面積計(jì)算DHEA含量,結(jié)果以(μg/100 g)甘薯渣干粉計(jì)。甘薯渣中DHEA含量計(jì)算公式:

式中:X:樣品中DHEA含量(μg/100 g);S1:樣品峰面積;S2:標(biāo)準(zhǔn)峰面積;C:標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度(μg/mL);V:樣品定容體積(μL);M:試樣質(zhì)量(g)。

1.2.3 供試菌菌種活化及菌懸液的制備 無菌條件下,用接種環(huán)分別挑取斜面培養(yǎng)基上的供試菌菌落,置于已滅菌的固體培養(yǎng)基上劃線(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌;LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)炭疽桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌;MRS培養(yǎng)基用于培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌;YPD培養(yǎng)基用于培養(yǎng)馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母),恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h(37 ℃)后,用接種環(huán)挑取單菌落至相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃雙層空氣恒溫振蕩器擴(kuò)大培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期(37 ℃,150 r/min),即得到活化的供試菌。利用麥?zhǔn)媳葷岱╗24-25]將菌株制成一定濃度的菌懸液。

1.2.4 DHEA抑菌活性研究 用硫酸和氯化鋇按一定的比例配制溶液,生成的硫酸鋇沉淀用漩渦振蕩器混合均勻后,在OD260 nm處測(cè)量吸光度值,用麥?zhǔn)媳葷岱ɡL制菌懸液標(biāo)準(zhǔn)曲線。菌懸液的標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式為:Y=4.1X-0.21338,相關(guān)系數(shù)R2為0.9946,標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性較好,可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線公式進(jìn)行計(jì)算。本試驗(yàn)所用供試菌標(biāo)準(zhǔn)菌懸液濃度約為2×108cfu/mL。取供試菌各100 μL涂布平板(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌;LB培養(yǎng)基培養(yǎng)炭疽桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌;MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌;YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母),用直徑為6 mm的打孔器打孔,每孔加濃度為100 mg/mL的 DHEA樣品50 μL,37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察DHEA對(duì)不同菌的抑菌活性,并測(cè)量抑菌圈直徑的大小。

1.2.5 DHEA的MIC及MBC的測(cè)定 用二倍稀釋法[26]將DHEA樣品稀釋成128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL系列濃度稀釋液,與供試菌振蕩混合后,置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。液體培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌;LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)炭疽桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌;MRS培養(yǎng)基用于培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌;YPD培養(yǎng)基用于培養(yǎng)馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母)中無渾濁為最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)。取無渾濁的培養(yǎng)液接種于固體培養(yǎng)基平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察,沒有細(xì)菌生長的為樣品對(duì)供試菌的最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)。

1.2.6 生長曲線的測(cè)定 抑菌物質(zhì)加入到供試菌培養(yǎng)液中后,供試菌的耐受性不同,生長會(huì)受到不同程度的影響,表現(xiàn)出培養(yǎng)基中供試菌的濁度不同[27]。故根據(jù)不同時(shí)間測(cè)定的培養(yǎng)基中指示菌的吸光度[28]可測(cè)定抑菌物質(zhì)DHEA對(duì)指示菌生長曲線的影響。在裝有100 mL的液體培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌;LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)炭疽桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌;MRS培養(yǎng)基用于培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌;YPD培養(yǎng)基用于培養(yǎng)馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母)的帶側(cè)臂的培養(yǎng)瓶中接種供試菌并調(diào)整指示菌菌體濃度為2×108cfu/mL,加入DHEA濃度為最小抑菌濃度的一半,在37 ℃下培養(yǎng),每隔2 h測(cè)定吸光值。以不加DHEA為對(duì)照,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光度(OD260 nm)為縱坐標(biāo),繪制供試菌的生長曲線。

1.2.7 指示菌的電鏡觀察菌體形態(tài) 采用掃描電鏡(Scanning electron microscopy,SEM)對(duì)DHEA處理和未處理的細(xì)菌進(jìn)行菌體形態(tài)掃描觀察[29],濃度設(shè)定為EC50(半最大效應(yīng)濃度)。掃描電鏡樣品的制備方法:取培養(yǎng)一定時(shí)間的供試菌,無菌超純水清洗2～3次,離心洗去殘余培養(yǎng)基,水洗后加入用體積含量為4%的戊二酸重懸菌體,固定細(xì)胞形態(tài)(4 ℃,2 h以上),用pH為6.8的磷酸緩沖液沖洗6次洗去殘余戊二醛(20 min/次,4 ℃),用體積含量為30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇梯度洗脫脫水(30 min/次,4 ℃),用100%丙酮脫水3次,用乙酸異戊酯進(jìn)行置換2次(30 min/次,4 ℃),樣品冷凍干燥,將樣品粘臺(tái)進(jìn)行真空噴金,觀察果膠的縱向表面和橫截面的形狀,并拍照。測(cè)定參數(shù)為:加速電壓:30 kV;電流:20 mA;步長:0.05°/2θ;掃描速度:0.05°/min。在1000～3000放大倍數(shù)范圍內(nèi)觀察菌體形態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)中涉及的每組試驗(yàn)均重復(fù)3次,所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,利用Orgin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHEA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

如圖1,橫縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度X(mg/mL),縱坐標(biāo)為峰面積值Y(mAU)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出該色譜條件下的線性回歸方程為Y=98.733X-874.89,R2=0.9992。

圖1 DHEA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of DHEA

2.2 HPLC測(cè)定甘薯中DHEA含量

由圖2可得,標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間為7.195 min,樣品峰出峰時(shí)間為7.043 min,此外14.27 min時(shí)又出現(xiàn)一個(gè)峰,此種物質(zhì)不明,可能是雜質(zhì),待進(jìn)一步檢測(cè)。經(jīng)超聲波微波協(xié)同提取甘薯渣中DHEA,提取量為117.25 μg/100 g。提取得到的DHEA在制備液相上進(jìn)一步純化,DHEA的純度為90%～98%,收集樣品備用。

圖2 DHEA標(biāo)準(zhǔn)品及甘薯渣中提取DHEA樣品HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of DHEA contrast and from sweet potato residues

2.3 抑菌活性

由圖3可知,去氫表雄酮對(duì)革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌)、革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)、真菌(馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母)均有抑制作用。對(duì)馬克斯克魯維酵母、大腸桿菌抑制最明顯,對(duì)金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌、沙門氏菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌次之,但對(duì)鼠李糖乳桿菌抑制作用不明顯。由表1可知,抑菌圈直徑大小為:馬克斯克魯維酵母>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>炭疽桿菌>沙門氏菌>釀酒酵母>枯草芽孢桿菌>鼠李糖乳桿菌。

圖3 DHEA的抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of DHEA 注:CK:對(duì)照;1:馬克斯克魯維酵母;2:釀酒酵母;3:鼠李糖乳桿菌;4:大腸桿菌5:枯草芽孢桿菌;6:炭疽桿菌;7:沙門氏菌;8:金黃色葡萄球菌。

表1 DHEA對(duì)供試菌的抑菌直徑(mm)Table 1 DHEA for bacteriostatic diameter of tested bacteria(mm)

2.4 DHEA抗菌效力MIC、MBC的測(cè)定

樣品的MIC和MBC越小,其抑菌作用越明顯。由表2可知,DHEA對(duì)馬克斯克魯維酵母、大腸桿菌作用最為明顯,其MIC分別為(5.67±0.21)、(9.82±0.35) mg/mL,MBC分別為(9.79±0.14)、(18.36±0.18) mg/mL。

表2 DHEA對(duì)供試菌的MIC和MBC(mg/mL)Table 2 DHEA for MIC and MBC of tested bacteria(mg/mL)

研究中發(fā)現(xiàn),在所選菌株中,除鼠李糖乳桿菌,DHEA對(duì)其他菌株具有抑制作用。DHEA對(duì)指示菌殺菌作用大小分別為:馬克斯克魯維酵母>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>炭疽桿菌>沙門氏菌>枯草芽孢桿菌>釀酒酵母>鼠李糖乳桿菌(-)。

2.5 DHEA對(duì)供示菌生長曲線的影響

由圖4可知,DHEA對(duì)馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌生長曲線均有影響。由圖4A、圖4B可知,DHEA使馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母生長曲線對(duì)數(shù)期縮短,穩(wěn)定期延長。由圖4C可知,DHEA對(duì)鼠李糖乳桿菌無抑制作用不明顯,菌體生長曲線無明顯變化。由圖4D可知,DHEA使大腸桿菌對(duì)數(shù)期縮短穩(wěn)定期延長,并使菌體濃度下降。由圖4E可知DHEA對(duì)枯草芽孢桿菌生長也有影響。由圖4F可知,DHEA對(duì)炭疽桿菌生長曲線有影響,對(duì)數(shù)期菌體濃度下降。由圖4G可知,DHEA使沙門氏菌菌落總數(shù)下降,生長期延長,對(duì)數(shù)期縮短,隨著時(shí)間延長菌體濃度整體下降。由圖4H可知,DHEA對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用,菌落總數(shù)下降,生長期延長,對(duì)數(shù)期縮短,隨著時(shí)間延長菌體濃度整體下降。

圖4 DHEA對(duì)指示菌生長曲線的影響Fig.4 Effects of DHEA on the growth curve of indicator注:A:馬克斯克魯維酵母;B:釀酒酵母;C:鼠李糖乳桿菌;D:大腸桿菌;E:枯草芽孢桿菌;F:炭疽桿菌;G:沙門氏菌;H:金黃色葡萄球菌。

2.6 指示菌掃描電鏡觀察

以不加DHEA正常生長情況下的指示菌為對(duì)照,用掃描電鏡觀察DHEA對(duì)指示菌菌體形態(tài)的影響。由圖5可知,DHEA對(duì)馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)均有影響,空白對(duì)照下的以上指示菌菌體形態(tài)正常,細(xì)胞飽滿,細(xì)胞內(nèi)容物分布均勻,經(jīng)DHEA處理后菌體形態(tài)一定程度上改變,菌體邊緣有毛刺,細(xì)胞壁有破裂,細(xì)胞內(nèi)容物有部分溶出。可見,DHEA對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞壁有作用力,可通過破壞其細(xì)胞壁,使細(xì)胞內(nèi)容物溶出致使菌體死亡。觀察鼠李糖乳桿菌掃描電鏡,發(fā)現(xiàn)對(duì)照和處理后形態(tài)無明顯變化,這也從微觀形態(tài)說明DHEA對(duì)其無影響。

圖5 DHEA對(duì)供試菌細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.5 Effect of DHEA on cell morphology of tested strains注:a:馬克斯克魯維酵母;b:釀酒酵母;c:鼠李糖乳桿菌;d:大腸桿菌;e:枯草芽孢桿菌;f:炭疽桿菌;g:沙門氏菌;h:金黃色葡萄球菌。

3 討論

甘薯渣提取物DHEA具有抑菌作用,不同生物體其生物免疫系統(tǒng)不同[30],故對(duì)供試菌有不同的抑制作用,尤其對(duì)馬克斯克魯維酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌作用力敏感,對(duì)益生菌鼠李糖乳桿菌無抑制作用。這可能與去氫表雄酮本身的生物活性有關(guān),其具體作用機(jī)制還不明確,有待進(jìn)一步的研究論證。對(duì)甘薯渣中DHEA進(jìn)行提取時(shí),在提取后應(yīng)用冷凍干燥,干燥后放入棕瓶中低溫避光保存,以免失去活性。未經(jīng)純化的樣品應(yīng)及時(shí)進(jìn)行純化收集,避免放置時(shí)間久樣品抑菌活性成分減弱。甘薯渣為農(nóng)副產(chǎn)品加工副產(chǎn)物,從中提取活性物質(zhì)成分能很好的提高甘薯的附加值[24-25]。從中提取DHEA,有利于甘薯渣的回收利用對(duì)拓寬其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用途徑具有一定意義。

4 結(jié)論

DHEA對(duì)供試菌的抑菌效果依次為:馬克斯克魯維酵母>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>炭疽桿菌>沙門氏菌>枯草芽孢桿菌>釀酒酵母>鼠李糖乳桿菌。最低抑制濃度(MIC)結(jié)果為:馬克斯克魯維酵母5.67 mg/mL,大腸桿菌9.82 mg/mL,金黃色葡萄球菌13.52 mg/mL,炭疽桿菌16.46 mg/mL,沙門氏菌17.68 mg/mL,枯草芽孢桿菌17.87 mg/mL,釀酒酵母20.82 mg/mL,而對(duì)鼠李糖乳桿菌無明顯抑制作用。DHEA使供試菌生長周期縮短,并降低了菌體濃度;掃描電鏡顯示DHEA處理后菌體形態(tài)改變,細(xì)胞壁破裂,細(xì)胞內(nèi)容物有溶出。甘薯渣中DHEA抑菌作用的研究,為去氫表雄酮及農(nóng)副產(chǎn)品的綜合利用提供新的思路和途徑。