趙夢馨，周幗萍*，黃庭軒，王安琪，楊祖順，國譯丹，范 璐

（1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.University High School，Irvine CA 92612；3.云南省疾病預(yù)防控制中心食品安全與營養(yǎng)研究中心，云南 昆明 650022）

高產(chǎn)、營養(yǎng)、美味的玉米是很多國家和地區(qū)的主食之一，其各種深加工制品也深受消費(fèi)者喜歡，由玉米制作的吊漿粑（也稱酵米面）是一種在南方部分地區(qū)廣為盛行的自制發(fā)酵食物，吊漿粑在制作及保存過程中很容易被唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli）污染，導(dǎo)致食物中毒，甚至致死。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌廣泛存在于自然環(huán)境（土壤、水源等）[1]、醫(yī)院環(huán)境[2-5]及食品（銀耳等）[6]中，致病力非常復(fù)雜，該菌導(dǎo)致的食物中毒事件在我國時有發(fā)生。我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.29—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗(yàn)》[7]稱其病原菌為椰毒假單胞菌（Pseudomonas cocovenenans）或椰毒假單胞菌酵米面亞種（P.cocovenenans subsp.farinofermentans），但國際微生物分類命名系統(tǒng)已將原椰毒假單胞菌改名為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌，所以國外文獻(xiàn)資料及進(jìn)口微生物鑒定設(shè)備數(shù)據(jù)庫中均廢止了椰毒假單胞菌名稱[8]。

現(xiàn)有的微生物鑒定方法很多，李曉琍等[9]采用于馬玲薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中添加抗生素的方法優(yōu)化對B.gladioli的檢出；NADINEM等[10]對印尼食物中毒事件中的分離株B.gladioli進(jìn)行全基因組測序分析，確定其菌株同源性；FALCONERT M等[11]采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法得出導(dǎo)致食物中毒的非洲粟酒中病原菌為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌，以上鑒定方法各有其優(yōu)點(diǎn)。生理生化鑒定是微生物鑒定的經(jīng)典方法，由于其對設(shè)備要求低，也是實(shí)驗(yàn)室采用的基本鑒定方法。隨著實(shí)驗(yàn)條件的改進(jìn)和設(shè)備升級，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）等設(shè)備昂貴的質(zhì)譜鑒定法也開始應(yīng)用。而價格低廉、準(zhǔn)確，鑒定種類和適用性更為廣泛的管家基因序列分析等基于測序的分子生物學(xué)方法則廣受歡迎。

本研究采用VITEK 2 COMPACT生理生化、MALDITOF-MS和rec A序列分析3種方法對云南省疾控中心提供的13株疑似唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（B.gladioli）進(jìn)行鑒定，并比較和評價這3種方法在唐菖蒲伯克霍爾德氏菌鑒定方面的優(yōu)缺點(diǎn)，旨在探究出能夠快速、準(zhǔn)確鑒別唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的方法，對該菌株的常規(guī)檢測和疾病控制有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

標(biāo)準(zhǔn)及參照菌株：用于質(zhì)譜鑒定和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR）擴(kuò)增的陽性對照菌株編號及來源見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)及參比菌株Table 1 Standard strains and reference strains used in the experiment

疑似菌株：云南疾控中心。其中菌株WS24、WS32來源于土壤，菌株HH18、HH19、WS18、WS22、WS26、WS34來源于玉米面、菌株WS03、WS23、WS27來源于玉米桿，菌株WS09來源于吊漿粑，菌株HH08來源于吊漿糯米面。

質(zhì)控菌株ATCC 29522為大腸桿菌（Escherichia coli）：由云南省疾控中心提供。

1.1.2 試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基：英國OXOID公司；GVC增菌液和卵黃瓊脂平板：北京陸橋技術(shù)公司；VITEK 2 COMPACT GN鑒定卡：法國梅里埃公司；Premix Taq、DL2000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、核酸染料Goldview：日本TaKaRa公司；瓊脂糖（生化試劑）：西班牙Biowest公司；甲酸（formic acid，F(xiàn)A）、三氟乙酸（trifluoracetic acid，TFA）、乙腈（acetonitrile，ACN）、無水乙醇、基質(zhì)2-氰基-4-羥基肉桂酸（2-cuano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）（均為色譜純），細(xì)菌質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（bacterial test standard，BTS）：德國布魯克公司；PCR引物：金唯智科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD潔凈工作臺：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣凈化技術(shù)有限公司；VITEK 2COMPACT全自動微生物鑒定儀：法國梅里埃公司；Cycler PCR儀：美國Bio-Rad公司；BIOBEST 1200A凝膠圖像分析系統(tǒng)：美國西蒙公司；Autoflex Speed基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀：德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 生理生化鑒定

按照VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析儀的說明書對13株唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的疑似菌株進(jìn)行生理生化鑒定，并結(jié)合GB/T 4789.29—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗(yàn)》及伯杰氏手冊[12]對13株唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的疑似菌株生理生化特性進(jìn)行分析。

1.3.2 MALDI-TOF-MS鑒定

標(biāo)準(zhǔn)溶液：50%乙腈、2.5%三氟乙酸和47.5%超純水；基質(zhì)溶液：用250μL標(biāo)準(zhǔn)溶液溶解CHCA成品，混勻，保存?zhèn)溆?。?0μL標(biāo)準(zhǔn)溶液溶解2μL BTS標(biāo)準(zhǔn)品，反復(fù)吹打混勻，注意避免出現(xiàn)氣泡，靜置5 min后再吹打不少于20次，每管分裝5μL，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將13株疑似菌株接種于PDA培養(yǎng)基，于36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用甲酸萃取法[13]進(jìn)行樣品制備：用無菌棉棒挑取適量菌落（約5 mg）放入1.5 mL Eppendorf管中，加入300μL純水混勻，再加入900μL無水乙醇混勻，12 000 r/min離心2 min，棄上清，再向管中加入50μL 70%的FA和50μL ACN，12 000 r/min離心2 min，取上清液轉(zhuǎn)移到新Eppendorf管中。取1μL上清液加在MALDI-TOF-MS的樣品靶上，在室溫條件下自然晾干，晾干后立即滴加1μL基質(zhì)溶液均勻覆蓋，自然晾干后備用。同時，以上述同樣方法向靶上滴加溶解后的BTS進(jìn)行校正。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

用溶解后的BTS對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)后，應(yīng)用MALDI Biotyper軟件對樣品圖譜信息進(jìn)行采集和分析，并自動鑒定菌種結(jié)果。

1.3.3 rec A序列分析

將13株唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的疑似菌株劃線于PDA平板，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于裝有50μL MilliQ水的PCR管中，搖勻后于98℃條件下裂解10 min后，12 000 r/min離心5 min，上清液為疑似菌株的DNA模板，冷藏于4℃冰箱，待用。

rec A PCR擴(kuò)增體系：2×Taq PCRMaster Mix 25μL，正向引物rec A-F（5′-GATAGCAAGAAGGGCTCC-3′）2 μL，反向引物rec A-R（5′-CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC-3′）[14]2μL，DNA模板5μL，加無菌水至50μL。

rec A PCR擴(kuò)增條件：94℃、5min；94℃、30s，59℃、30s，72 ℃、45 s，循環(huán)30次；72 ℃、5min。

所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州金唯智公司進(jìn)行測序。所得序列提交至GenBank，用MEGA6.0軟件中的鄰近法（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 生理生化鑒定結(jié)果

13株疑似唐菖蒲伯克霍爾德氏菌菌株的生理生化鑒定結(jié)果見表2，其中存在差異的生理生化指標(biāo)測定結(jié)果見表3。

表2 VITEK 2 COMPACT生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of VITEK 2 COMPACT physiological and biochemical tests

表3 分離株的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of isolated strains

由表2和表3可知，13株疑似菌株中8株（WS03、WS09、WS22、WS32、WS34、HH18、HH08、HH19）被鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderiagladioli），其生理生化特性和標(biāo)準(zhǔn)株CICC10574基本相同，但有5株（WS18、WS23、WS24、WS26、WS27）疑似菌則被鑒定為棲稻假單胞菌（Pseudomonas oryzihabitans）。

目前生理生化依然是國內(nèi)外各種標(biāo)準(zhǔn)中的主要方法，也是基層實(shí)驗(yàn)室的主要甚至是唯一方法，所以比較了伯杰氏手冊、VITEK 2 COMPACT系統(tǒng)和國標(biāo)對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的生理生化特性的描述。VITEK 2 COMPACT的47個生理生化特性中，13株唐菖蒲伯克霍爾德分離株和標(biāo)準(zhǔn)株CICC10574在側(cè)金盞花醇、谷氨酰芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶、D-山梨醇、丙二酸鹽醇和香豆酸鹽6個生理生化指標(biāo)上有差異，其余41個指標(biāo)則完全一致。其中影響最大的生理生化指標(biāo)是D-山梨醇：伯杰氏手冊（第九版）中描述唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的該項(xiàng)指標(biāo)為陽性，故有35%的菌株（5/13）因D-山梨醇特性差異而被VITEK 2 COMPACT鑒定為棲稻假單胞菌（P.oryzihabitans），而其他5項(xiàng)生理生化特性的差異并未影響VITEK 2 COMPACT的最終鑒定結(jié)果。伯杰氏手冊（第九版）中描述典型株ATCC10248的D-塔格糖和丙二酸鹽兩個生理生化特性指標(biāo)為陽性，但被測的13株疑似菌株和1株標(biāo)準(zhǔn)菌株中0%和14.3%的菌株這兩項(xiàng)為陽性；GB/T 4789.29—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗(yàn)》要求唐菖蒲伯克霍爾德氏菌側(cè)金盞花醇為陽性，實(shí)際上被測菌株中只有28.6%的菌株該項(xiàng)指標(biāo)為陽性；但這3項(xiàng)生理生化指標(biāo)的陰性結(jié)果并不影響VITEK 2 COMPACT鑒定疑似菌為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌。這些生理生化特性的差異，尤其是國標(biāo)和伯杰氏手冊中提到的4項(xiàng)指標(biāo)的差異值得高度重視，以免在生理生化鑒定中發(fā)生偏差。

2.2 MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果

參考VITEK2 COMPACT生理生化鑒定結(jié)果，以唐菖蒲伯克霍爾德氏菌標(biāo)準(zhǔn)株作為參比，對標(biāo)準(zhǔn)株和13株疑似菌株進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，部分菌株的質(zhì)譜圖見圖1，測定結(jié)果見表4。

匹配分?jǐn)?shù)在2.300～3.000之間，表示極有可能的菌種鑒定；在2.000～2.299之間，表示保守的菌種鑒定或可能的菌種鑒定。由圖1可知，13株疑似菌質(zhì)譜圖與唐菖蒲伯克霍爾德氏菌標(biāo)準(zhǔn)株CICC10574基本一致，特別是VITEK 2 COMPACT鑒定為棲稻假單胞菌的5個疑似菌株和唐菖蒲伯克霍爾德氏菌標(biāo)準(zhǔn)株的峰圖高度一致。由表4可知，13株疑似菌株的得分在2.000～3.000之間，其中標(biāo)準(zhǔn)株CICC10574的分值為2.105，VITEK 2COMPACT鑒定為棲稻假單胞菌的5株疑似菌株得分范圍在2.200～2.400之間，平均值為2.300；VITEK 2 COMPACT鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德8株菌株得分范圍在2.000～2.500之間，平均值為2.306，表明兩者之間無顯著性差異（P＞0.05）。因此，MALDI-TOF-MS鑒定13株疑似菌株為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderiagladioli）。

圖1 部分菌株的MALDI-TOF-MS圖Fig.1 MALDI-TOF-MS spectrum of some strains

表4 質(zhì)譜最佳匹配菌株及其得分Table 4 Optimum matching strain and score by MS

續(xù)表

2.3 rec A序列分析

伯克霍爾德氏菌在16SrRNA序列上過于保守，不適合用于鑒定到種，故其他管家基因被開發(fā)用于種的鑒定，其中rec A序列已被證實(shí)在伯克霍爾德屬內(nèi)區(qū)分70多個種，具有很好的效果[15-17]。因此，在Genbank數(shù)據(jù)庫中選取伯克霍爾德屬內(nèi)唐菖蒲伯克霍爾德種及其近源種菌株的rec A序列信息進(jìn)行比對并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。

圖2 rec A序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees based on rec A sequences analysis

由圖2可以看出，以伯克霍爾德種內(nèi)rec A序列分析所構(gòu)建的進(jìn)化樹中13株疑似菌株與唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（B.gladioli）的典型株LMG2216、曾是椰毒假單胞菌（Pseudomonas cocovenenans）的典型株LMG11626及數(shù)據(jù)庫中其他唐菖蒲伯克霍爾德氏菌株高度同源，也與食物中毒致病分離株YDHH、YD1、YD2和YD4同源，卻與同屬其他種的菌株之間的區(qū)別非常明顯，bootstrap值達(dá)到98，特別是與近源、在16SrRNA序列分析中很難區(qū)分的兩種植物致病菌細(xì)菌水稻細(xì)菌性-谷枯病菌（B.glumae）和水稻幼苗枯萎的病原菌-植物伯克霍爾德（B.plantarii）區(qū)分度很高，說明rec A序列分析適合鑒定唐菖蒲伯克霍爾德氏菌。

唐菖蒲伯克霍爾德種內(nèi)菌株多樣性也非常復(fù)雜，既有產(chǎn)毒的食源性致病株，也有植物致病株和環(huán)境分離株，系統(tǒng)發(fā)育樹中，分離株HH08、WS03和WS09與兩次食物中毒事件的致病菌株YD1、YD2、YD4和YDHH位于同一個進(jìn)化分支上，并與產(chǎn)毒素的原椰毒假單胞菌典型株LMG11626近源；菌株WS34與美國唐菖蒲中分離出的植物病原菌LMG2216近源；而分離株WS22、WS23、WS24、WS27、WS32以及HH19與環(huán)境分離株唐菖蒲伯克霍爾德氏菌CICC10574位于同一進(jìn)化分支。這意味著rec A序列分析在區(qū)分唐菖蒲伯克霍爾德氏菌不同亞種、變種上有參考價值。

2.4 3種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌鑒定方法的比較

將3種不同鑒定方法的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)MALDITOF-MS鑒定方法和rec A序列方法鑒定結(jié)果完全一致，因此，鑒定13株疑似菌株為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（B.gladioli）。但VITEK 2 COMPACT生理生化鑒定結(jié)果卻與MALDITOF-MS鑒定方法和rec A序列方法的鑒定結(jié)果出現(xiàn)了很大的差異。

3種鑒定方法比較來看，分子生物學(xué)方法最為精確，適用性強(qiáng)，價格低廉。經(jīng)典的16SrRNA序列分析有通用引物，可鑒定到屬，且?guī)缀跛性宋⑸锏?6SrRNA都在GenBank等免費(fèi)開放性數(shù)據(jù)庫中可供比較[18]；但是保守序列因?yàn)樾蛄斜Ｊ匦缘?，不適合鑒定到種的水平，需要自己設(shè)計(jì)適合不同科屬微生物特異性引物，且參比序列遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于16SrRNA的序列，但基本涵蓋了各屬中常見重要種的序列信息。菌株經(jīng)純化、活化后，序列分析法鑒定需要6～48 h。質(zhì)譜方法鑒定僅需6～8.5 min，且準(zhǔn)確性高，對于臨床上確診病例進(jìn)而有針對性明確治療方案極為重要[19]，其缺點(diǎn)是設(shè)備價格昂貴。生理生化法是應(yīng)用最久、最為廣泛的經(jīng)典微生物鑒定方法，雖然VITEK 2 COMPACT自動化儀器提高了鑒定效率并減少人為操作誤差，但同種的不同菌株之間在很多生理生化指標(biāo)上并不一致，這導(dǎo)致相當(dāng)高的誤判幾率。雖然像FDA標(biāo)準(zhǔn)采用陽性率85%的形式提醒鑒定人員注意該種內(nèi)菌株間在生理生化指標(biāo)上存在的差異性，但是這讓鑒定結(jié)果更難決斷[20]。

3 結(jié)論

采用VITEK 2 COMPACT生理生化、MALDI-TOF-MS和rec A序列分析3種方法對13株唐菖蒲伯克霍爾德氏菌疑似菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，經(jīng)VITEK 2 COMPACT生理生化鑒定鑒定后，8株菌株鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli），5株菌株鑒定為棲稻假單胞菌（Pseudomonasoryzihabitans）；經(jīng)MALDI-TOF-MS與rec A序列分析鑒定，13株菌株均被鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（B.gladioli）。在13株唐菖蒲伯克霍爾德氏菌疑似菌的鑒定方法中，MALDI-TOF-MS法和rec A序列分析法鑒定結(jié)果準(zhǔn)確一致，而VITEK 2 COMPACT生化檢測法存在缺陷，38%的菌株主要因D-山梨醇利用特性不同于典型株而被誤判為棲稻假單胞菌。相比傳統(tǒng)生化鑒定方法，MALDITOF-MS方法和rec A序列分析法在唐菖蒲伯克霍爾德氏菌鑒定中更為快速、準(zhǔn)確。