伍娜娜，康 超，榮 娜，劉 祥*，陳春琳，陳 琛，丁 銳，吳三橋

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院/中德天然產(chǎn)物研究所，陜西 漢中 723001； 2.陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中723001)

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)是隸屬于弧菌科弧菌屬的嗜鹽嗜溫性革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于海洋、河口、海水養(yǎng)殖池等水體環(huán)境中[1]，可引起水產(chǎn)貝、蝦、蟹、魚類等敗血癥和胃腸炎[2-6]，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[7]。同時該菌是一種人畜共患致病菌，可污染人類的食物，引起腹瀉、創(chuàng)傷感染、中耳炎等多種疾病[8-10]，嚴重危害人類健康?？股厥欠乐稳茉寤【腥镜闹饕瘜W藥物[11]，但長期使用抗生素，難免出現(xiàn)藥物殘留、細菌耐藥性提高等問題。因此，迫切需要研發(fā)一種新型疫苗來防治溶藻弧菌疾病。

溶藻弧菌轉(zhuǎn)運蛋白TolB是一種周質(zhì)蛋白[12]，與外膜脂蛋白Pal相互作用以介導內(nèi)外層之間的接觸，可促進運輸并保持膜完整性，其運動依賴于生物聚合物轉(zhuǎn)運[13]。龐歡瑛等[8]用溶藻弧菌TolB蛋白免疫石斑魚發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌TolB蛋白可激活石斑魚體內(nèi)的特異免疫反應，且對石斑魚的免疫保護率達76%，表明溶藻弧菌TolB蛋白有較好的免疫保護功能，能有效抵抗溶藻弧菌對機體的感染，是一種很好的候選疫苗蛋白。

為進一步提高溶藻弧菌TolB蛋白的免疫功能，借助生物信息學軟件，為溶藻弧菌轉(zhuǎn)運蛋白TolB構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，預測和分析其基本理化性質(zhì)、信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)與卷曲螺旋、三級結(jié)構(gòu)以及優(yōu)勢的B、T細胞抗原表位，設計重組表位多肽疫苗，為溶藻弧菌TolB蛋白疫苗的研制，尤其是多表位串聯(lián)疫苗的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的溶藻弧菌轉(zhuǎn)運蛋白TolB序列(登錄號：WP_005387925.1)，共含450個氨基酸，序列如下：MIRRLLLGMFVLFSSMTNVANAALELVITDGIDSARPIAVVPFKWEGTQALPTDVSAVIASDL-QRSGKFSPVPTSKMPQTPFSESEVNFDAWTNLGVDA-LLTGSIKQNDQGDYVINYQLVDIVRGQLTGGKSKAL-GSDGELVLSKDHVLFNKVATVQGPRMREYAHRISD-LVYEQLTGDRGAFMTRIAYVVVNDKDRFPYQLRVA-DYDGYNERLVLRSKQPLMSPAWSPDGKKLAYVSFQ-NGQAEIFIMNIYTGEREKITSYPRHNGAPRFSPDGNK-LAIVLSKTGSLHVYTFDLNTRKLTQITRGRSNNTEPF-WHPDGKSLIFTSDRGGKPQIYQVNLGSGSIDRLTWQ-GSQNLGGQITPDGRFLVMVNRSNAGFNLAKQDLET-GALQVLTKTLLDESPSIAPNGGMVVYSSIYNKKNVL-SMVSIDGRFKARLPATNGRVRAPAWSPFL。

1.2 方法

1.2.1 進化關系分析 利用DNAMAN 8.0軟件，將NCBI數(shù)據(jù)庫公布的不同菌株TolB蛋白的氨基酸序列進行同源性分析，采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 理化性質(zhì)分析 采用ExPASy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)網(wǎng)絡在線軟件對溶藻弧菌TolB蛋白相對分子質(zhì)量、親水性、等電點、脂肪指數(shù)、穩(wěn)定性進行預測分析；采用ProtScale analysis方法預測親水性圖譜。

1.2.3 信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)與高級結(jié)構(gòu)分析 采用Signal P 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)軟件對溶藻弧菌TolB蛋白進行信號肽預測；利用TMHMM Serverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)隱馬爾科夫模型對其跨膜結(jié)構(gòu)進行分析。利用SOPMA、SWISS-MODEL在線預測軟件，分別對溶藻弧菌TolB蛋白進行二級、三級結(jié)構(gòu)預測。

1.2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析 通過String蛋白質(zhì)相互作用預測網(wǎng)站(http://www.string-db.org/)，預測溶藻弧菌TolB蛋白與其他蛋白質(zhì)的相互作用關系網(wǎng)絡。

1.2.5 細胞抗原表位分析 綜合BepiPred 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)方法和ABCpred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html)方法預測溶藻弧菌TolB蛋白的B細胞表位，獲得其優(yōu)勢肽段。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原表位采用在線軟件nHLAPred(http://www.imtech.res.in/raghava/nhlapred/comp.html)，運用神經(jīng)網(wǎng)絡與量化矩陣法進行預測； 通過ProPred在線軟件預測輔助T細胞(Th)抗原表位。

1.2.6 串聯(lián)表位重組預測 為了篩選抗原性較好的組合作為多表位疫苗的最佳氨基酸序列，首先將獲得的優(yōu)勢抗原表位按照B細胞、CTL及Th抗原表位順序依次編號，其次在相鄰表位間添加4個甘氨酸(GGGG)進行柔性分割，再利用DNASTAR 7.1軟件對獲得的B、T表位肽段進行不同排列組合優(yōu)化，再將其翻譯為核酸序列，從而獲得最終的重組表位多肽及核苷酸序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶藻弧菌TolB蛋白氨基酸序列的同源性與系統(tǒng)發(fā)生分析

采取生物信息學軟件DNAMAN 8.0對不同菌株的TolB蛋白氨基酸序列同源性進行分析，結(jié)果顯示，TolB蛋白在不同種類的細菌中序列一致性較強， TolB蛋白的功能在這些細菌中具有相似性(圖1)。利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，同一菌屬在進化分支上位置較近，其中溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和費氏弧菌進化距離更近(圖2)。這4種菌的TolB蛋白序列具有較高同源性，推測TolB蛋白免疫動物產(chǎn)生的特異性抗體，可能對這4種菌的感染存在交叉免疫保護作用。

圖1 TolB蛋白氨基酸序列同源性分析

圖2 TolB蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進化關系分析

2.2 溶藻弧菌TolB蛋白理化性質(zhì)分析

通過ExPASy-ProtParam在線預測軟件對溶藻弧菌TolB蛋白進行理化性質(zhì)預測，結(jié)果顯示，其相對分子質(zhì)量為49737.67，等電點為9.49，脂肪指數(shù)(Aliphatic index)為86.20；不穩(wěn)定指數(shù)(II)為33.71，表明溶藻弧菌ToIB蛋白屬于穩(wěn)定蛋白；平均親水性(GRAVY)為-0.273，表明溶藻弧菌TolB蛋白為親水性蛋白(圖3)。

圖3 溶藻弧菌TolB蛋白疏水性分析

2.3 溶藻弧菌TolB蛋白信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)分析

采用Signal P 4.1軟件對溶藻弧菌TolB蛋白進行信號肽預測，結(jié)果顯示，溶藻弧菌TolB蛋白的信號肽序列由N端的22個氨基酸殘基組成(1—22位)，切割位點在第22—23個氨基酸殘基(圖4)。應用TMHMM Serverv 2.0軟件對溶藻弧菌TolB蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果顯示，TolB蛋白沒有跨膜區(qū)，所有區(qū)域均在細胞膜外，是一種外膜蛋白(圖5)。

2.4 溶藻弧菌TolB蛋白高級結(jié)構(gòu)預測

使用SOPMA在線預測軟件對溶藻弧菌TolB蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測，可信度為82.00%，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲占比分別為18.67%、11.33%和40.00%(圖6)?？梢?，溶藻弧菌TolB蛋白無規(guī)則卷曲含量較高，該部位可能存在抗原表位。通過SWISS-MODEL在線預測軟件模擬溶藻弧菌TolB蛋白三維空間結(jié)構(gòu)(圖7A)，發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌TolB蛋白主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成，其次是β-轉(zhuǎn)角，與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果具有一致性。溶藻弧菌TolB蛋白三維空間結(jié)構(gòu)模型覆蓋率為100%，可靠性較高(圖7B)。

圖4 溶藻弧菌TolB蛋白信號肽預測

圖5 溶藻弧菌TolB蛋白跨膜區(qū)預測

c:無規(guī)則卷曲; e:β-片層; h:α-螺旋; t:β-轉(zhuǎn)角圖6 溶藻弧菌TolB蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

2.5 溶藻弧菌TolB蛋白作用網(wǎng)絡分析

對溶藻弧菌TolB蛋白進行預測，結(jié)果顯示，溶藻弧菌TolB與10種蛋白質(zhì)存在相互作用，其中pal蛋白、lky蛋白、tolQ蛋白、ybgF蛋白與TolB蛋白作用更為緊密(圖8)。

2.6 溶藻弧菌TolB蛋白B細胞抗原表位預測

綜合ABCpred方法和BepiPred 2.0方法預測溶藻弧菌TolB蛋白B細胞抗原表位，獲得細胞優(yōu)勢抗原表位為64—79、171—181、254—264、428—435位(表1—2)。

圖7 溶藻弧菌TolB蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

圖8 溶藻弧菌TolB蛋白相互作用蛋白質(zhì)預測

2.7 溶藻弧菌TolB蛋白T細胞抗原表位分析

2.7.1 溶藻弧菌TolB蛋白CTL抗原表位預測 CTL表位預測采用nHLAPred軟件，運用神經(jīng)網(wǎng)絡與量化矩陣法，選用HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203，HLA-A*0205五種分子結(jié)合肽(表3)，獲得TolB的CTL抗原表位為148—156位的VLFNKVATV。

表1 ABCpred 方法預測溶藻弧菌TolB蛋白B細胞抗原表位的肽段位置

表2 BepiPred 2.0方法預測溶藻弧菌TolB蛋白B細胞抗原表位的肽段位置

表3 溶藻弧菌TolB蛋白CTL抗原表位預測

續(xù)表3 溶藻弧菌TolB蛋白CTL抗原表位預測

2.7.2 溶藻弧菌TolB蛋白Th抗原表位預測 應用在線軟件ProPred對溶藻弧菌TolB蛋白進行Th抗原表位預測，選用DRB1-0101、DRB1-0102、DRB1-0301 三種不同多肽類型(表4)。綜合相同抗原表位序列分析得到，溶藻弧菌TolB蛋白的Th抗原表位是26—34位的LVITDGIDS。

表4 溶藻弧菌TolB蛋白Th抗原表位預測

2.8 溶藻弧菌TolB蛋白重組串聯(lián)抗原表位的設計

為得到抗原性較好的串聯(lián)表位序列，將獲得的B、T抗原表位進行編號，在相鄰表位間添加4個甘氨酸(GGGG)作為柔性片段，再用DNASTAR 7.1，將B細胞表位設置為epitope1—epitope4，CTL表位設置為epitope5，Th表位設為epitope6，分析線性表位的各種排列方式，對不同的排列組合進行優(yōu)化，選取最佳順序為epitope1-epitope6-epitope3-epitope2-epitope5-epitope4(圖9)。轉(zhuǎn)化成氨基酸序列為：QRSGKFSPVPTSKMPQGGGGLVITDGIDSGGGGGEREKITSYP-RGGGGLVYEQLTGDRGGGGGVLFNKVATVGGGGG-RFKARLP(下劃線為柔性片段)。翻譯成核酸序列為CAACGTAGTGGTAAATTTAGCCCAGTTCCAACG-AGCAAAATGCCACAAGGTGGCGGTGGCGTGCTGTT-CAATAAAGTAGCCACTGTTGGTGGCGGTGGCGGTG-AACGTGAGAAAATTACTTCATACCCACGTGGTGGC-GGTGGCTTGGTGTATGAGCAGTTGACTGGCGACCG-TGGCGGTGGCGGTGGCTTGGTCATTACCGATGGTA-TTGATTCAGGTGGCGGTGGCGGTCGATTCAAAGCT-AGATTACCG(下劃線為柔性片段核酸序列)。

圖9 溶藻弧菌TolB蛋白重組表位多肽抗原指數(shù)分析

3 結(jié)論與討論

生物信息學分析是目前分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的重要手段[14-15]，可進行蛋白質(zhì)進化關系、理化性質(zhì)及高級結(jié)構(gòu)的準確預測[16]，尤其在蛋白質(zhì)的抗原表位分析和設計方面，有降低試驗盲目性，提高工作效率等特點，在疫苗研制上被應用廣泛[17]。

溶藻弧菌TolB氨基酸序列系統(tǒng)進行發(fā)生分析顯示，溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和費氏弧菌親緣關系較近，表明溶藻弧菌TolB蛋白對這4種菌的感染可能存在交叉免疫保護作用，這為蛋白質(zhì)多肽疫苗的研制奠定了基礎。這4種菌形態(tài)上均為弧菌，可見本研究得到的分子學分類結(jié)果與形態(tài)學分類結(jié)果相一致。預測發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌TolB蛋白為親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)，存在信號肽序列，表明溶藻弧菌TolB蛋白位于細胞膜外。因而，TolB蛋白與宿主免疫系統(tǒng)存在直接的相互作用，推測TolB蛋白易于激活宿主的免疫功能，從而具有較高的免疫原性[8]。溶藻弧菌TolB蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占40.00%，而此結(jié)構(gòu)易形成盤旋、扭曲，暴露在蛋白質(zhì)外層，成為優(yōu)勢細胞抗原表位的可能性較大[18]，為抗原表位的存在奠定基礎。

目前， B細胞表位的常用預測方法有BepiPred、ABCpred和DNASTAR[19]。BepiPred方法主要是利用隱馬爾可夫模型以及氨基酸的特定性質(zhì)進行線性表位的預測[20]；基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡算法的ABCpred方法，預測結(jié)果準確率較高[21]。同時使用2種方法，可提高預測的準確性[22]。本研究結(jié)合BepiPred 2.0與ABCpred方法對溶藻弧菌TolB蛋白B細胞表位預測，并結(jié)合二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，選取抗原性較好的無規(guī)則卷曲位置作為B細胞表位序列，最終獲得溶藻弧菌TolB蛋白B細胞表位為64—79、171—181、254—264、428—435位。這為串聯(lián)表位疫苗的設計提供了理論依據(jù)。

CTL細胞表位是抗原中與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合后，經(jīng)過抗原呈遞作用，可激活CTL細胞免疫的短肽，常見預測CTL細胞表位的方法有神經(jīng)網(wǎng)絡與量化矩陣法、IEDB、SYFPEITHI、BIMAS、IMTECH、NetCTL和NetMHC等[18,23-26]，在腫瘤、病毒、細菌和寄生蟲CTL抗原表位預測上均有應用[24,27]。本研究采用神經(jīng)網(wǎng)絡與量化矩陣法對溶藻弧菌TolB蛋白的CTL表位分析，結(jié)果得到該蛋白CTL表位為148—156位的VLFNKVATV，這些溶藻弧菌TolB蛋白的肽段可能與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合，經(jīng)過呈遞作用，最終活化CTL細胞的細胞毒作用。

Th細胞表位是抗原中與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合后，會增強機體免疫反應能力的短肽，表達于APC表面，而被CD4+T細胞識別結(jié)合，活化Th細胞以輔助B細胞產(chǎn)生抗體[28]。本試驗通過選取3類不同等位基因的Th表位進行分析，獲得溶藻弧菌TolB蛋白的Th表位區(qū)段為，26—34位的LVITDGIDS，這些Th表位序列可能與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合形成復合物，經(jīng)抗原呈遞后激活機體的免疫反應。表位疫苗是一種可同時攜帶多個抗原表位及輔助性表位的疫苗，具有安全性好、易操作和可控等優(yōu)點[29]。劉昆梅等[30]設計的多表位疫苗，不僅結(jié)構(gòu)合理且有較強的反應原性。預測溶藻弧菌TolB蛋白細胞表位，對研發(fā)TolB蛋白表位疫苗具有重要意義。

本研究對溶藻弧菌TolB蛋白的生物學分析，成功預測到其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征，并得到了抗原性較好的重組多肽。為TolB蛋白的深入研究以及疫苗和免疫診斷試劑的研制奠定了理論基礎。然而，該蛋白新合成的重組多肽免疫保護功能還有待于更深層次的研究和闡釋。