陳 蒙，袁赫海，楊銘慧，張 宇，劉海峰

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

山葡萄(Vitisamurensis)為葡萄科葡萄屬，主要分布在吉林、遼寧和內(nèi)蒙古等地區(qū)[1-2]，是栽培范圍最廣泛的果樹種類之一，在生產(chǎn)中具有重要地位。

山葡萄果皮顏色的深淺，主要取決于花色苷的含量[3-4]?；ㄉ展δ芎芏?，除了使植物器官產(chǎn)生不同顏色，還作用于種子傳播、授粉、抵抗病原物侵染、防紫外線損傷等方面[5-7]。類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)是花色苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，主要作用是將不穩(wěn)定的花色苷轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的花色苷[8]。有學(xué)者對多種植物的3GT進(jìn)行了研究[9-15]，成功克隆出了3GT基因但均未進(jìn)行蛋白方面的表達(dá)研究。本試驗(yàn)根據(jù)劉海峰等[16]的方法從山葡萄上分離克隆得到類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(VAm3GT，GenBank登錄號：FJ169463)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對山葡萄果皮8個(gè)不同轉(zhuǎn)色時(shí)期的VAm3GT表達(dá)量進(jìn)行分析并進(jìn)行原核表達(dá)載體的構(gòu)建。針對VAm3GT基因進(jìn)行表達(dá)分析，證實(shí)克隆所獲得的目的基因的準(zhǔn)確性，旨在為全面開展花色苷的降解機(jī)制、花色苷穩(wěn)定性研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 山葡萄品種雙豐(VitisamurensisShuang Feng)采自延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院山葡萄種質(zhì)資源圃。于果實(shí)成熟期采摘，取果皮作為供試材料，置于液氮中冷凍，-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 試劑 選用試劑盒GoScriptTM(Promega公司)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄；選用SYBR?GreenⅠ試劑盒(QIAGEN公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測；大腸桿菌(Escherichiacoli)的菌株DH5α和BL21、原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院保存； pMD18-T載體、ExTaq-聚合酶(TaKaRa公司)；膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶(Promega公司)；T4連接酶、SDS-PAGE電泳凝膠試劑盒(上海生工生物公司)；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)已克隆出的VAm3GT的ORF序列[9]，設(shè)計(jì)符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR要求的引物為VAm3GT1s：5′-TCGGAAATCTAAACTCGCTCTT-3′，VAm3GT1a：

5′-ATCATTGGTTAGGGAATCGTC-3′，及含有EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物為VAm3GT2s： 5′-cgGAATTCatgtctcaaaccaccaccaaccc-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，VAm3GT2a：5′tcCCGGGCtagacatcctttggttttgacact-3′(下劃線為SmaⅠ酶切位點(diǎn))。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

山葡萄雙豐分為8個(gè)取樣時(shí)期：轉(zhuǎn)色前Ⅱ期(花后4周)、轉(zhuǎn)色前、轉(zhuǎn)色10%、轉(zhuǎn)色30%、轉(zhuǎn)色50%、轉(zhuǎn)色80%、轉(zhuǎn)色100%、完熟期。采用改良CTAB法[17]提取山葡萄8個(gè)取樣時(shí)期的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)參基因選用action(Accession No.AB073011)。從8個(gè)取樣時(shí)期的cDNA 模板中任選其一，依次稀釋1、5、25、125、625倍制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)，擴(kuò)增體系：2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix10μL，QN ROX Reference Dye1 μL、引物A 0.5 μL、引物B 0.5 μL、RNase-Free H2O 7μL、模板cDNA1μL、總體積20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s，60℃ 退火30 s，60 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。擴(kuò)增完畢后，對實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。利用MxPro軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以VAm3GT全長cDNA為模版，根據(jù)設(shè)計(jì)的帶有酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增ORF序列。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性3 min，94 ℃ 變性 30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃終加延伸5 min。

將含有EcoR Ⅰ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)的VAm3GTORF和pET28a原核表達(dá)載體同時(shí)用EcoR Ⅰ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切，回收原核表達(dá)載體大片段和目的基因片段并用T4 DNA 連接酶16℃ 連接過夜，體系如下：10×T4 Ligase 2.0 μL、酶切PCR產(chǎn)物1.5 μL、酶切pET28a 3.0 μL、T4連接酶0.5 μL、ddH2O13.0 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于100 mg /L氨芐抗性固體LB培養(yǎng)基37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET28a-VAm3GT轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定后挑取陽性單克隆菌落接種于5 mL含100 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)。取過夜菌100 μL轉(zhuǎn)入5 mL含100 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度分別為0.8、1.0、1.2 mmol/L。置于28 ℃下振蕩培養(yǎng)8 h，獲得誘導(dǎo)菌液。

重組蛋白的SDS-PAGE檢測：取1 mL誘導(dǎo)菌液和誘導(dǎo)前樣品，12 000 r/min離心1 min，收集菌體，加入200 μL PBS緩沖液懸浮菌體并用槍頭吹打重懸，用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞；收集混合液后4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清和沉淀樣品中分別加入100 μL 5×上樣緩沖液并混勻，100 ℃水浴處理8 min。吸取30 μL加樣于10% SDS-PAGE電泳，凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 VAm3GT基因的表達(dá)分析

2.1.1 山葡萄果皮8個(gè)不同轉(zhuǎn)色時(shí)期的總RNA 采用改良CTAB法[17]提取山葡萄8個(gè)不同轉(zhuǎn)色時(shí)期的總RNA，如圖1所示。使用核酸檢測儀和凝膠成像儀檢測RNA濃度和質(zhì)量，保證RNA完整、無雜質(zhì)污染，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

M：DL 2000Marker，1：轉(zhuǎn)色前Ⅱ期RNA，2：轉(zhuǎn)色前RNA，3：轉(zhuǎn)色10%RNA，4：轉(zhuǎn)色30%RNA，5：轉(zhuǎn)色50%RNA，6：轉(zhuǎn)色80%RNA，7：轉(zhuǎn)色100%RNA，8：完熟期RNA

2.1.2 8個(gè)不同轉(zhuǎn)色時(shí)期VAm3GT基因的表達(dá)分析 選任一時(shí)期為對照，以action為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，探究VAm3GT基因在8個(gè)不同轉(zhuǎn)色時(shí)期的表達(dá)規(guī)律。如圖2所示，VAm3GT基因從轉(zhuǎn)色前Ⅱ期(花后4周)到完熟期表達(dá)量逐次遞增，呈遞增趨勢。

圖2 VAm3GT基因在8個(gè)不同轉(zhuǎn)色時(shí)期的表達(dá)

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以VAm3GT全長cDNA為模版，PCR擴(kuò)增含有EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)的VAm3GTORF序列，擴(kuò)增產(chǎn)物在1 371 bp出現(xiàn)與預(yù)期相符的特異性條帶(圖3)，回收進(jìn)行測序鑒定正確后，用于表達(dá)載體的構(gòu)建。將目的片段和表達(dá)載體pET28a進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶連接后，獲得重組質(zhì)粒pET28a-VAm3GT原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化并進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明，獲得的目的條帶與預(yù)期大小一致，且測序正確，原核表達(dá)載體已構(gòu)建成功。

M：DL 2000Marker，1：目的基因，2：目的基因酶切片段，3：pET28a質(zhì)粒雙酶切，4：重組質(zhì)粒VAm3GT特異擴(kuò)增檢驗(yàn)

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET28a-VAm3GT轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21后，加入IPTG誘導(dǎo)菌體表達(dá)。在28 ℃培養(yǎng)條件下對IPTG濃度進(jìn)行篩選，分別為0.8、1.0、1.2 mmol/L，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。目的蛋白在上清中且IPTG誘導(dǎo)濃度為0.8 mmol/L(圖4A)，約50.19 ku處有一條與預(yù)測重組VAm3GT蛋白相對分子質(zhì)量大小一致、較高濃度的誘導(dǎo)表達(dá)帶，沉淀與對照組均未出現(xiàn)目的蛋白條帶(圖4B)。

M：分子質(zhì)量標(biāo)記,1：對照(未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)),2：0.8 mmol/L IPTG,3：1.0 mmol/L IPTG,4： 1.2 mmol/L IPTG

3 結(jié)論與討論

3.1 VAm3GT基因的表達(dá)水平分析

8個(gè)不同轉(zhuǎn)色時(shí)期VAm3GT基因的表達(dá)量呈遞增趨勢，這與彩色馬鈴薯中3GT基因表達(dá)規(guī)律相同[18]。黃春輝等[19]證實(shí)了花青苷的積累與3GT基因的含量增加具有相關(guān)性，因此推測山葡萄果皮逐漸由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罴t色是由于3GT基因的不斷積累。

王惠聰?shù)萚7]對荔枝果皮花青苷的研究表明，3GT活性的變化與花青苷含量的變化趨勢吻合，隨著妃子笑果皮中3GT活性的增加花青苷含量上升。Owens[20]在紅葡萄果皮中檢測到3GT的表達(dá)，而在無花色素苷積累的白葡萄及紅葡萄其他組織中沒有檢測到3GT的表達(dá)。3GT酶在山葡萄果皮發(fā)育期至全紅期表達(dá)量緩慢增加，到果實(shí)完熟期表達(dá)量大幅度增加，催化花青素大量合成。果實(shí)在轉(zhuǎn)色前期沒有花青素的積累但3GT表達(dá)量仍然很高，由此推測山葡萄發(fā)育前期3GT酶參并催化合成了黃酮醇類物質(zhì)[21]。綜上所述，VAm3GT基因促進(jìn)了花色苷的積累，而其含量的增高是否受其他因素如光照、調(diào)節(jié)酶等影響還有待進(jìn)一步研究。

3.2 原核表達(dá)獲得表達(dá)蛋白

外源基因能否成功在大腸桿菌中正確表達(dá)，受諸多因素影響。不同植物3GT基因的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量均在50 ku左右。SDS-PAGE電泳檢測分析表明，目的蛋白在上清中且IPTG誘導(dǎo)濃度為0.8 mmol/L處有一條與預(yù)測重組VAm3GT蛋白相對分子質(zhì)量大小一致、較高濃度的誘導(dǎo)表達(dá)帶，沉淀與對照組均未出現(xiàn)目的蛋白條帶，這可能與原核表達(dá)目的蛋白通常以包涵體的形式表達(dá)有關(guān)。目的蛋白在IPTG濃度相對低時(shí)大量表達(dá)，這一結(jié)果與牟利等[22]對青稞F7-OMT基因的原核表達(dá)分析結(jié)果一致。VAm3GT基因在適宜的誘導(dǎo)條件下可得到穩(wěn)定表達(dá)的可溶性目的蛋白。通過對該基因的原核表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了克隆所獲得的目的基因的準(zhǔn)確性。

本研究成功構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-VAm3GT，在28 ℃、8 h，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.8 mmol/L條件下，目的蛋白在上清中有較高的表達(dá)量，獲得了具有較高可溶性且能夠高效表達(dá)的目的蛋白。為VAm3GT酶活分析、蛋白的純化以及多克隆抗體的制備等后續(xù)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。