趙華 陳瑩蓉 宋鵬濤 余才華 吳巍 馬志紅

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內居各種惡性腫瘤之首[1]。腫瘤根據(jù)病理學類型可分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌，其中NSCLC約占85%。近年研究表明微小RNA（microRNA，miRNA）在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移等進程中起著重要的作用[2-4]。筆者在前期研究中應用miRNA芯片技術篩選NSCLC組織中差異表達的miRNA發(fā)現(xiàn)，miR-4286在NSCLC癌組織中的表達水平顯著升高；進一步采用生物信息學方法進行數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，miR-4286與星形膠質細胞上調基因-1（astrocyte elevated gene-1，AEG-1）的啟動子區(qū)域互補，miR-4286可能通過靶向AEG-1啟動子序列以激活AEG-1的轉錄或翻譯，共同參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。本研究中筆者采用原位雜交方法和免疫組織化學染色分別檢測miR-4286和AEG-1在140例NSCLC癌組織及配對癌旁正常組織中的表達，分析兩者表達水平與NSCLC臨床病理特征的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 人NSCLC組織芯片（芯片編號：HLug-Squ150CS01、HLugA150CS02）購自上海芯超生物科技有限公司。150例NSCLC患者樣本來源于國家人類遺傳資源共享服務平臺（2005DKA21300），剔除信息不全及脫靶等因素，共入組患者140例，男105例，女35例；年齡 35～72（60.25±9.22）歲；腫瘤直徑≤3cm 102 例，＞3cm 38例；腺癌72例，鱗癌68例；TNM分期：Ⅰ期59例，Ⅱ期45例，Ⅲ期27例，Ⅳ期9例；淋巴結轉移59例，未轉移81例；遠處轉移9例，未轉移131例；腫瘤分化程度：Ⅰ期19例，Ⅱ期84例，Ⅲ期37例。所有患者均經(jīng)臨床確診且術前未接受放、化療，手術切除組織包含癌組織和相匹配的距離癌組織邊緣5cm以上的癌旁正常組織。離體組織經(jīng)常規(guī)4%甲醛固定并石蠟包埋，5μm厚度切片，制成直徑1.5mm的組織芯片。

1.2 原位雜交方法 按照丹麥 Exiqon公司的原位雜交試劑盒 miRCURY LNATMmicroRNA ISH Optimization Kit（FFPE）（No.90008）的操作說明進行實驗。組織芯片脫蠟水化后，蛋白酶 K（15μg/ml）37℃孵育 15min。將梯度乙醇脫水后的芯片置于55℃預雜交30min，接著加入90℃變性的地高辛標記探針miR-4286（丹麥Exiqon公司，YD00610917-BCG，1∶500）雜交工作液于 55℃孵育過夜。次日經(jīng)過梯度洗片和封閉后，加入Anti-DIG-AP（美國 Roche 公司，No.11093274910，1∶800） 室溫孵育1h。最后采用NBT/BCIP染色，核固紅復染后封片鏡檢。用已知的陽性切片作陽性對照，用PBS替代探針作陰性對照。

1.3 免疫組織化學染色 免疫組織化學染色參照文獻[5]。大體步驟為石蠟切片脫蠟水化后，經(jīng)3%H2O2封閉，高壓法抗原修復，然后加入兔抗人單克隆抗體AEG-1（英國 Abcam 公司，ab124789，1∶300）4℃孵育過夜，次日辣根酶標記山羊抗兔IgG聚合物孵育30min，最后采用DAB染色，蘇木素復染，鏡像觀察。

1.4 結果判斷 miR-4286和AEG-1在NSCLC癌組織、癌旁正常組織中的陽性染色分別為紅色至深紫色和淡黃色至棕褐色。對陽性染色腫瘤細胞比例和染色強度進行計分。陽性腫瘤細胞比例：無陽性腫瘤細胞計0分，≤25%計1分，26%～50%計2分，＞50%計3分。miR-4286與AEG-1的染色強度評分分別為：均無染色計0分，紅色與淡黃色計1分（弱染色），紫色與棕黃色計2分（中等染色），深紫色與棕褐色計3分（強染色）。最終以陽性腫瘤細胞比例計分×染色強度計分表示miR-4286和AEG-1的表達水平，0～3分為低表達，4～9分為高表達。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC組織中miR-4286與AEG-1的表達 原位雜交結果顯示，miR-4286陽性染色主要定位于NSCLC癌組織、癌旁正常組織的胞質或細胞核，著色為紅色至深紫色，見圖1（插頁）。140例NSCLC癌組織中miR-4286高表達率為62.14%（87/140），高于癌旁正常組織的4.29%（6/140），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。免疫組織化學檢測結果顯示，AEG-1陽性染色主要位于胞質、核膜和細胞連接處。在NSCLC癌組織中AEG-1中等染色，呈棕黃色；在癌旁正常組織中AEG-1染色缺失或弱染色，見圖2（插頁）。NSCLC癌組織中AEG-1高表達率為 55.71%（78/140），高于癌旁正常組織的7.86%（11/140），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 miR-4286和AEG-1表達與NSCLC臨床病理特征的關系 miR-4286高表達與患者腫瘤直徑大小、腫瘤TNM分期和淋巴結轉移均有關（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤組織類型、遠處轉移和腫瘤分化程度均無關（均P＞0.05）。AEG-1高表達與腫瘤TNM分期和淋巴結轉移均有關（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤直徑大小、腫瘤組織類型、遠處轉移和腫瘤分化程度均無關（均P＞0.05），見表1。

2.3 NSCLC癌組織中miR-4286與AEG-1表達的相關性分析 經(jīng)Spearman等級相關分析，miR-4286的表達與 AEG-1的表達呈正相關（r=0.223，P=0.008），見表2。

表1 NSCLC癌組織中m i R-4286和AEG-1表達與NSCLC臨床病理特征的關系（例）

表2 140例NSCLC癌組織中m i R-4286與AEG-1表達的關系（例）

3 討論

miRNA具有廣泛的基因調節(jié)功能，可通過對其靶基因的調控作用，參與多種生物學行為，如細胞生長、凋亡、分化、器官發(fā)育等，包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2-4]。最近有研究報道，miRNA也可通過與目的基因的啟動子區(qū)域序列結合抑制阻遏子的表達，從而誘導目的基因的表達上調[6]。本研究中，筆者通過生物信息學方法發(fā)現(xiàn)miR-4286與AEG-1基因的啟動子序列結合，并在NSCLC癌組織中觀察到miR-4286與AEG-1的表達一致升高，通過Spearman等級相關分析發(fā)現(xiàn)NSCLC癌組織中miR-4286與AEG-1的表達呈正相關。

miR-4286是一個在人胚胎干細胞早期分化進程中篩選出的新發(fā)現(xiàn)的miRNA，在黑色素瘤、食管癌及直腸癌中可觀察到miR-4286表達的上調[7-10]。本研究中，筆者采用原位雜交方法檢測NSCLC組織中miR-4286的表達發(fā)現(xiàn)，miR-4286在NSCLC癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義。miR-4286的陽性染色定位于NSCLC癌組織、癌旁正常組織的胞質或細胞核，染色呈紅色至深紫色。此外，miR-4286在NSCLC癌組織中的高表達與患者腫瘤直徑大小、腫瘤TNM分期和淋巴結轉移均有關。以上結果表明miR-4286在NSCLC的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，但具體作用機制有待進一步研究。

為研究NSCLC組織中miR-4286的表達上升是否與AEG-1的表達相關，筆者采用了免疫組織化學染色檢測了相應組織芯片中AEG-1的蛋白表達。AEG-1是一個在HIV-I感染或TNF-α誘導的人胚胎星形細胞中表達上調的基因，其高表達被認為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移等密切相關[11-12]。本研究中，AEG-1在NSCLC癌組織中的高表達率顯著高于癌旁正常組織，且其高表達與腫瘤TNM分期和淋巴結轉移均有關，該結果與筆者先前的報道相符[5]。此外，經(jīng)Spearman等級相關分析顯示NSCLC癌組織中miR-4286的表達與AEG-1的表達呈正相關，提示兩者高表達共同參與了NSCLC的發(fā)生與轉移。

綜上所述，miR-4286與AEG-1在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，并協(xié)同參與了NSCLC的發(fā)生與轉移等進程，抑制miR-4286或AEG-1的表達可望成為NSCLC靶向治療的新途徑。