楊毅 郭麗 李文燕 韓晨陽(yáng)

來(lái)那度胺是沙利度胺的衍生物之一，屬于第二代免疫調(diào)節(jié)藥物[1]。來(lái)那度胺能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫，臨床主要用于各種惡性血液系統(tǒng)疾病的輔助治療，批準(zhǔn)的適應(yīng)證主要是骨髓增生異常綜合征中的5q-綜合征和多發(fā)性骨髓瘤。雖然后期在實(shí)體瘤的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，來(lái)那度胺可以抑制腫瘤血管的形成、增強(qiáng)體內(nèi)免疫反應(yīng)等[2-3]，但是在實(shí)體瘤的應(yīng)用中始終具有一定的局限性。目前程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD1）抑制劑是腫瘤免疫抑制治療的研究熱點(diǎn)，PD1及其配體（PD1/PD-L1）作為免疫抑制的主要通路，在腫瘤免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。而前期研究中鮮有文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)那度胺對(duì)免疫抑制的調(diào)節(jié)作用，就腫瘤藥物的研究，尋找一種既可以提高免疫功能又可以降低免疫抑制的藥物是有積極意義的。本研究通過(guò)觀察來(lái)那度胺對(duì)Lewis荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞亞群/樹(shù)突狀細(xì)胞比例和PD1/PD-L1通路的影響，探討來(lái)那度胺經(jīng)免疫途徑治療實(shí)體瘤的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)近親系C57BL/6J雄性小鼠40只，8～10周齡，體重18～22g，購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（浙）2013-0184）]，分籠飼養(yǎng)，每籠8只，共5籠。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度為20～25℃，濕度為（70±5）%，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物干燥飼料喂養(yǎng)，小鼠活動(dòng)、攝食自由。

1.2 細(xì)胞株與試劑 Lewis肺癌細(xì)胞株購(gòu)于武漢普諾賽生物技術(shù)有限公司。來(lái)那度胺購(gòu)于武漢卡斯恩化工有限公司（醫(yī)藥級(jí)，貨號(hào)15002719264），F(xiàn)ITC標(biāo)記的小鼠CD4、CD80抗體，PE標(biāo)記的小鼠CD8、CD11c抗體購(gòu)于美國(guó)Bio Legend公司。PD1、PD-L1的一抗和二抗購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.3 來(lái)那度胺對(duì)細(xì)胞的毒性作用鑒定 Lewis肺癌細(xì)胞株進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，待對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)消化得到細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2×106/ml，在96孔板中每孔加入細(xì)胞懸液100μl，設(shè)置對(duì)照組和來(lái)那度胺組（濃度依次為 1、5、10、20、40、80μM），每組 5 個(gè)復(fù)孔分別培養(yǎng)24、48和 72h，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力，Hoechst 33258染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

1.3.1 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞貼壁后用不同終濃度來(lái)那度胺干預(yù)一定時(shí)間后，棄去培養(yǎng)基，加入100μl的新培養(yǎng)基和10μl的CCK8溶液繼續(xù)孵育4h，同時(shí)設(shè)置空白培養(yǎng)基為對(duì)照，酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞吸光度值（A），計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=[（實(shí)驗(yàn)組A-空白對(duì)照A）/（對(duì)照組A-空白對(duì)照A）]×100%。

1.3.2 Hoechst 33258染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞 將細(xì)胞接種到24孔板中，待細(xì)胞貼壁后用終濃度為80μl的來(lái)那度胺干預(yù)一定時(shí)間后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次后甲醇固定，加入Hoechst 33258染色液染色0.5h后，PBS洗3次后在鏡下觀察細(xì)胞，其中藍(lán)色強(qiáng)熒光為陽(yáng)性細(xì)胞，代表凋亡細(xì)胞。

1.4 小鼠造模和分組 取正常小鼠，在無(wú)菌條件下取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lewis肺癌細(xì)胞株進(jìn)行接種，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2×106/ml，在每只小鼠右側(cè)腋窩下接種細(xì)胞懸液0.5ml，接種后常規(guī)飼養(yǎng)5d，選取荷瘤建模成功的小鼠分設(shè)模型組、來(lái)那度胺低劑量組（1mg/kg）和高劑量組（10mg/kg），另?yè)裾Ｐ∈笤O(shè)為對(duì)照組，每組10只。來(lái)那

度胺用0.9%氯化鈉溶液配置成50mg/ml混懸液，低劑量組劑量為1mg/kg，高劑量組劑量為10mg/kg，對(duì)照組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，均每天灌胃1次，連續(xù)14d，斷頸處死，取腫瘤組織和外周血進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 體內(nèi)抑瘤率測(cè)定 實(shí) 驗(yàn)期間每日觀察小鼠的生長(zhǎng)期情況和腫瘤大小，給藥14d后處死小鼠，解剖并分離腫瘤，對(duì)腫瘤進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=（模型組平均腫瘤重量-來(lái)那度胺組平均腫瘤重量）/模型組平均腫瘤重量×100%。

1.6 腫瘤細(xì)胞的分離 腫 瘤稱(chēng)重后，置于含有青霉素（100U）和鏈霉素（100μg/L）的培養(yǎng)基中浸泡 1 h，用無(wú)菌手術(shù)剪剪成小塊，加入膠原蛋白酶Ⅳ和脫氧核糖核酸酶（濃度均為0.05%），消化后進(jìn)行無(wú)菌銅網(wǎng)過(guò)濾，得到細(xì)胞懸液，1 500r/min離心10min得到細(xì)胞。

1.7 T淋巴細(xì)胞亞群/樹(shù)突狀細(xì)胞比例檢測(cè) 采 用流式細(xì)胞術(shù)。將上述分離得到的腫瘤細(xì)胞和外周血細(xì)胞調(diào)節(jié)濃度為1×106/ml，分別分設(shè)3管，每管加入0.5ml細(xì)胞懸液（含5×105個(gè)細(xì)胞），離心后棄去培養(yǎng)基后用PBS調(diào)整總體積為 1 00μl，第 1管中加入 C D4和 C D8抗體0.5μl，第 2 管中加入 C D11c 和 C D80 抗體 0 .5μl，第 3管為空白對(duì)照，避光孵育0.5h，PBS洗2次后上機(jī)檢測(cè)。

1.8 PD1/PD-L1蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。將分離得到的細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106/ml，用RIPA和PMSF提取細(xì)胞總蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取蛋白質(zhì)樣品，與5×蛋白上樣緩沖液混合，沸水煮5min變性，經(jīng)SDS-PAGE，蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的TBST封閉2h。加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次，5min/次，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，ECL顯影，曝光后用Image J軟件分析，蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)為每個(gè)蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值的比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 來(lái)那度胺對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒性作用在不同濃度來(lái)那度胺干預(yù)24、48和72h后，Lewis肺癌細(xì)胞株均未出現(xiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)，細(xì)胞活力均在95%以上。同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度來(lái)那度胺組與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），且不同濃度來(lái)那度胺組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。Hoechst 33258染色也證明細(xì)胞無(wú)顯著凋亡，提示來(lái)那度胺對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞株無(wú)明顯細(xì)胞毒性，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。

表1 不同濃度來(lái)那度胺干預(yù)后Lewi s肺癌細(xì)胞株的細(xì)胞活力（%）

2.2 來(lái)那度胺對(duì)Lewis荷瘤小鼠的抑瘤率 高劑量組、低劑量組腫瘤重量均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；高劑量組腫瘤重量低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高劑量組抑瘤率高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。2.3 來(lái)那度胺對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群/樹(shù)突狀細(xì)胞比例的影響 對(duì)于T淋巴細(xì)胞亞群，來(lái)那度胺可以提高腫瘤浸潤(rùn)組織和外周血中CD4+、CD8+比例。高劑量組、低劑量組CD4+、CD8+比例均高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；且高劑量組 CD4+、CD8+比例高于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。對(duì)于樹(shù)突狀細(xì)胞，來(lái)那度胺可以提高腫瘤浸潤(rùn)組織和外周血中 CD11c+、CD80+及兩者雙陽(yáng)性 （CD11c+CD80+）比例。高劑量組、低劑量組 CD11c+、CD80+、CD11c+CD80+比例均高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而低劑量組和高劑量組 CD11c+、CD80+和 CD11c+CD80+比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表3。

表2 來(lái)那度胺對(duì)Lewi s荷瘤小鼠的抑瘤率

表3 來(lái)那度胺對(duì)腫瘤浸潤(rùn)組織和外周血中T淋巴細(xì)胞亞群/樹(shù)突狀細(xì)胞比例的影響

2.4 來(lái)那度胺對(duì)腫瘤組織中PD1、PD-L1蛋白表達(dá)的影響 高劑量組、低劑量組PD1和PD-L1蛋白表達(dá)水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；高劑量組PD1和PD-L1蛋白表達(dá)水平均低于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖2和表4。

圖2 腫瘤組織中PD-1/PL-L1蛋白表達(dá)的電泳圖

表4 來(lái)那度胺對(duì)腫瘤組織中PD1、PD-L1蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后和人體自身的免疫是息息相關(guān)的，而機(jī)體的抗腫瘤免疫主要依靠自身的T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫[4]。成熟的T淋巴細(xì)胞一般分為CD4+和CD8+亞群，而缺乏CD4+和CD8+細(xì)胞可以直接導(dǎo)致機(jī)體免疫低下，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[5]。樹(shù)突狀細(xì)胞是目前人體內(nèi)功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者存在樹(shù)突狀細(xì)胞缺乏的免疫缺陷[6-7]。因此，淋巴細(xì)胞亞群的變化和樹(shù)突狀細(xì)胞的變化可以直接反映出機(jī)體的免疫功能。人體也存在免疫抑制功能，目前公認(rèn)的PD1和PD-L1在腫瘤細(xì)胞的淋巴細(xì)胞的相互結(jié)合中發(fā)揮重要的免疫抑制作用[8-9]。PD1是CD28超家族成員，表達(dá)在淋巴細(xì)胞的表面，且廣泛存在于各種T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞，而PD1的主要功能是調(diào)節(jié)效應(yīng)淋巴細(xì)胞的活化[10]。PD1的配體主要是PD-L1和PD-L2，在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)PD-L1和PD1結(jié)合后可以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的凋亡，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸和轉(zhuǎn)移，而PD-L1在多數(shù)腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，這證明PD1和PD-L1在腫瘤的免疫抑制中發(fā)揮著重要作用[11-12]。

來(lái)那度胺是一種新型的免疫調(diào)節(jié)制劑。以往研究發(fā)現(xiàn)，在免疫調(diào)節(jié)方面，它可以通過(guò)激活T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、同時(shí)提高NK細(xì)胞的比例并增強(qiáng)其功能。在非免疫調(diào)節(jié)方面，來(lái)那度胺可以抑制IL-6表達(dá)，通過(guò)Caspase-8的表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可以降低細(xì)胞色素C的釋放、抵抗腫瘤血管的生成[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)那度胺對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞株并無(wú)細(xì)胞毒性，不同劑量及延長(zhǎng)作用時(shí)間并未有顯著作用，提示來(lái)那度胺對(duì)腫瘤細(xì)胞不具有直接的殺傷作用。本研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)那度胺不僅可以提高腫瘤組織和外周血中CD4+、CD8+比例，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的殺傷作用，還可以提高樹(shù)突狀細(xì)胞比例，且高劑量效果優(yōu)于低劑量，說(shuō)明來(lái)那度胺對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖和功能的增強(qiáng)有著很好的調(diào)節(jié)作用。在樹(shù)突狀細(xì)胞的表達(dá)中同樣顯示了來(lái)那度胺的免疫增強(qiáng)作用，外周血和腫瘤組織中淋巴細(xì)胞亞群變化呈現(xiàn)高度一致性，說(shuō)明來(lái)那度胺不僅提高了腫瘤組織的免疫功能，還提高了機(jī)體整體的免疫功能。本研究發(fā)現(xiàn)Lewis荷瘤小鼠腫瘤組織中PD1和PD-L1蛋白水平呈高表達(dá)，這說(shuō)明免疫抑制水平較高。來(lái)那度胺干預(yù)后可以顯著降低腫瘤組織中PD1和PD-L1蛋白表達(dá)水平，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，低劑量下就有很好的抑制效果，這種表達(dá)下降說(shuō)明來(lái)那度胺可能對(duì)PD1/PD-L1信號(hào)有一定的干預(yù)作用，同時(shí)腫瘤重量明顯減輕，推測(cè)是由于來(lái)那度胺抑制PD1/PD-L1信號(hào)后提高了免疫殺傷作用。本研究發(fā)現(xiàn)來(lái)那度胺對(duì)實(shí)體瘤有一定的干預(yù)作用，機(jī)制可能與機(jī)體免疫功能的增強(qiáng)和免疫抑制信號(hào)的拮抗有關(guān)，在雙重作用下起到了抗實(shí)體瘤的作用。

綜上所述，來(lái)那度胺對(duì)肺癌實(shí)體瘤的作用不是通過(guò)細(xì)胞毒性，而是通過(guò)增強(qiáng)免疫功能，其機(jī)制可能與T淋巴細(xì)胞亞群、樹(shù)突狀細(xì)胞的調(diào)節(jié)及PD1/PD-L1的表達(dá)有關(guān)。